სიახლეები

გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს.ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვიყვანთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
კიბოს უჯრედებმა შეიმუშავეს სხვადასხვა მექანიზმები უჯრედული სტრესის დასაძლევად და პროგრესის გასაგრძელებლად.პროტეინ კინაზა R (PKR) და მისი ცილის აქტივატორი (PACT) არის საწყისი რეაგირება, რომლებიც აკონტროლებენ სხვადასხვა სტრესის სიგნალებს, რაც იწვევს უჯრედების პროლიფერაციისა და აპოპტოზის ინჰიბირებას.თუმცა, კიბოს უჯრედებში PACT-PKR გზის რეგულირება ძირითადად უცნობია.აქ ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ხანგრძლივი არაკოდირებადი რნმ (lncRNA) ასპარტილ tRNA სინთეტაზას ანტიმგრძნობიარე რნმ 1 (DARS-AS1) უშუალოდ მონაწილეობს PACT-PKR გზის ინჰიბირებაში და ხელს უწყობს კიბოს უჯრედების პროლიფერაციას.CRISPRi 971 კიბოსთან ასოცირებული lncRNA ფართომასშტაბიანი ფუნქციური სკრინინგის გამოყენებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ DARS-AS1 დაკავშირებულია კიბოს უჯრედების მნიშვნელოვნად გაძლიერებულ პროლიფერაციასთან.ამიტომ, DARS-AS1 ნოკაუტი აფერხებს უჯრედების პროლიფერაციას და ხელს უწყობს კიბოს უჯრედების აპოპტოზს სხვადასხვა კიბოს უჯრედულ ხაზებში in vitro და მნიშვნელოვნად ამცირებს სიმსივნის ზრდას in vivo.მექანიკურად, DARS-AS1 პირდაპირ უკავშირდება PACT აქტივაციის დომენს და ხელს უშლის PACT-PKR ურთიერთქმედებას, რითაც ამცირებს PKR აქტივაციას, eIF2α ფოსფორილირებას და აფერხებს აპოპტოზურ უჯრედულ სიკვდილს.კლინიკურად, DARS-AS1 ფართოდ არის გამოხატული მრავლობითი კიბოში და ამ lncRNA-ს გადაჭარბებული გამოხატვა ცუდი პროგნოზის მანიშნებელია.ეს კვლევა განმარტავს PACT-PKR გზის კიბოს სპეციფიკურ რეგულირებას DARS-AS1 lncRNA-ით და უზრუნველყოფს კიბოს პროგნოზისა და მკურნალობის კიდევ ერთ სამიზნეს.
სტრესთან ადაპტაციის უნარი კიბოს უჯრედების გადარჩენისა და პროლიფერაციის მნიშვნელოვანი მახასიათებელია.კიბოს სწრაფი გავრცელება და მეტაბოლური ნიშნები პიკს აღწევს მკაცრ მიკროგარემოებში - ნუტრიენტების ნაკლებობა, ჰიპოქსია და დაბალი pH - რამაც შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედების სიკვდილის სასიგნალო გზები.სტრესისადმი მგრძნობიარე გენების დისრეგულაცია, როგორიცაა p535, სითბური შოკის პროტეინები 6, 7, KRAS8, 9 და HIF-110, 11, 12, 13 ხშირად შეინიშნება კიბოში, რითაც ბლოკავს აპოპტოზს და ხელს უწყობს გადარჩენას.
პროტეინ კინაზა R (PKR) არის მნიშვნელოვანი სტრესის სენსორი და ევკარიოტული ინიცირების ფაქტორი 2α (eIF2α) კინაზა, მთარგმნელობითი რეგულატორი, რომელიც აკავშირებს უჯრედულ სტრესს უჯრედის სიკვდილთან.PKR თავდაპირველად იდენტიფიცირებული იყო, როგორც ანტივირუსული ცილა უცხო ორჯაჭვიანი რნმ-ის (dsRNA) გამოვლენით.გააქტიურებისას PKR ფოსფორილირდება eIF2α ვირუსული და ფიჭური ცილების სინთეზის ინჰიბირებისთვის14,15,16.PACT (PKR აქტივატორი ცილა) იდენტიფიცირებულია, როგორც პირველი PKR აქტივატორი ცილა dsRNA17,18,19,20,21,22,23 არარსებობის შემთხვევაში.PKR-თან პირდაპირი ურთიერთქმედებით, PACT გადასცემს სხვადასხვა სტრესს (შრატში შიმშილი, პეროქსიდით ან არსენიტის მკურნალობა) PKR-მდე და ქვედა დინების სასიგნალო გზებზე.eIF2α ფოსფორილირების გარდა, PACT შუამავლობით PKR აქტივაცია იწვევს სხვადასხვა მოვლენებს, რომლებიც დაკავშირებულია სტრესის რეაქციასთან, მათ შორის შეცვლილი რედოქსის სტატუსი PI3K/Akt24 გზის მეშვეობით, დნმ-ის დაზიანების გაძლიერებული შემოწმება p5325,26 და NF-κB27,28 არეგულირებს ტრანსკრიფციას, 29. სტრესის რეაქციაში, პროლიფერაციაში, აპოპტოზსა და სხვა საკვანძო უჯრედულ პროცესებში მათი კრიტიკული როლის გათვალისწინებით, PKR და PACT არის პერსპექტიული თერაპიული სამიზნეები მრავალი დაავადებისთვის, განსაკუთრებით კიბოსთვის30,31,32,33.თუმცა, მიუხედავად ამ პლეიოტროპული ფუნქციური და ბიოლოგიური მნიშვნელობისა, კიბოს უჯრედებში PACT/PKR აქტივობის რეგულირება ჯერ კიდევ მიუწვდომელია.
lncRNA არის 200 ნუკლეოტიდზე მეტი ტრანსკრიპტები, რომლებსაც არ გააჩნიათ ცილის კოდირების პოტენციალი.მას შემდეგ, რაც მთელი გენომის თანმიმდევრობის უახლესი პროექტები გამოავლინეს ათასობით lncRNA, 35,36 დიდი ძალისხმევა გაკეთდა მათი ბიოლოგიური ფუნქციების გასარკვევად.მზარდმა კვლევებმა აჩვენა, რომ lncRNA ჩართულია მრავალ ბიოლოგიურ პროცესში37, მათ შორის X-ქრომოსომის ინაქტივაციის რეგულაცია38,39, ბეჭდვა40, ტრანსკრიფცია41,42, ტრანსლაცია43 და კიბოს ზრდაც კი44,45,46,47.ამ კვლევებში ნათქვამია, რომ ბევრი lncRNA ჩართულია PACT/PKR გზაზე.ერთ-ერთმა ასეთმა კვლევამ აჩვენა, რომ lncRNA ASPACT აფერხებს PACT ტრანსკრიფციას და ზრდის PACT mRNA-ს ბირთვულ შეკავებას.სხვა კვლევებმა აჩვენა, რომ lncRNA nc886 უკავშირდება PKR-ს და აფერხებს მის ფოსფორილირებას49,50.ჯერჯერობით, არ არის მოხსენებული lncRNA, რომელიც არეგულირებს PACT შუამავლობით PKR აქტივაციას.
ასპარტილ-ტრნმ სინთეტაზას ანტიმგრძნობიარე რნმ 1 (DARS-AS1) იდენტიფიცირებულია, როგორც ონკოგენური lncRNA51,52,53,54.miP-194-5p53, miP-12952 და miP-532-3p51 რეგულირების მეშვეობით, DARS-AS1 ნაჩვენებია, რომ ხელს უწყობს თირკმელების უჯრედოვანი კარცინომის, ფარისებრი ჯირკვლის კარცინომის და ფილტვის არაწვრილუჯრედოვანი კარცინომის ზრდას, შესაბამისად.ტონგმა და კოლეგებმა ასევე დაადგინეს, რომ DARS-AS1 ხელს უწყობს მიელომის პროგრესირებას პროტეინ 39 (RBM39) რნმ-დაკავშირების მოტივის სტაბილურობის შენარჩუნებით.თუმცა, არ ჩატარებულა კვლევები იმის შესახებ, არის თუ არა ეს lncRNA ჩართული PACT-PKR აქტივაციის რეგულირებაში და კიბოს უჯრედების სტრესის რეაქციაში.
აქ ჩვენ შევასრულეთ ფართომასშტაბიანი ფუნქციის დაკარგვის ეკრანი CRISPRi სისტემის გამოყენებით და დავადგინეთ, რომ DARS-AS1 lncRNA ხელს უწყობს რამდენიმე ტიპის კიბოს უჯრედების გამრავლებას.გარდა ამისა, ჩვენ გამოვავლინეთ ძირითადი მექანიზმი: DARS-AS1 პირდაპირ უკავშირდება PACT-ს, აინჰიბირებს PACT და PKR დაკავშირებას, ხელს უშლის eIF2α, ქვედა PKR სუბსტრატის ფოსფორილირებას და საბოლოოდ აფერხებს აპოპტოზურ უჯრედების სიკვდილს.დასასრულს, ჩვენი ნაშრომი ავლენს DARS-AS1 lncRNA-ს, როგორც PACT-PKR გზის მარეგულირებელს და კიბოს მკურნალობისა და პროგნოზის პოტენციურ სამიზნეს.
გენომური პროფილირების ფართო კვლევებმა გამოავლინა ასობით lncRNA, რომლებიც დაკავშირებულია კიბოსთან.თუმცა მათი ფუნქცია დიდწილად უცნობი რჩება56.კიბოს პროგრესირებაში ჩართული პერსპექტიული lncRNA კანდიდატების იდენტიფიცირებისთვის, ჩვენ ჩავატარეთ ფუნქციის დაკარგვის სკრინინგი შემცირებული პროლიფერაციისთვის SW620 კოლორექტალური კიბოს უჯრედულ ხაზში CRISPRi სისტემის გამოყენებით (ნახ. 1a).SW480 და SW620 მსხვილი ნაწლავის კიბოს უჯრედული ხაზების უნიკალური თვისება არის ის, რომ ისინი წარმოიქმნება პირველადი და მეორადი სიმსივნეებიდან ერთ პაციენტში.ეს იძლევა ღირებულ შედარებას მსხვილი ნაწლავის კიბოს პროგრესირებაში გენეტიკური ცვლილებების შესასწავლად.აქედან გამომდინარე, ჩვენ გავაანალიზეთ კოლორექტალური კიბოს უჯრედული ხაზების ტრანსკრიპტომები (SW480 და SW620) რნმ-ის თანმიმდევრობის გამოყენებით და შევაგროვეთ რამდენიმე პოტენციური ფუნქციური lncRNA გამოქვეყნებული ლიტერატურიდან.ამ შედეგების საფუძველზე, ჩვენ შევქმენით გაერთიანებული sgRNA ბიბლიოთეკა, რომელიც შეიცავს 7355 sgRNA ოლიგოს, რომელიც მიზნად ისახავს 971 კიბოს ასოცირებულ lncRNA-ს და 500 არამიზნობრივ sgRNA ოლიგოს უარყოფითი კონტროლისთვის (დამატებითი მონაცემები 1).
სკრინინგის სქემატური წარმოდგენა CRISPri სისტემის გამოყენებით.b sgRNA გამდიდრება სკრინინგის შემდეგ.ჰორიზონტალური წერტილოვანი ხაზი წარმოადგენს log2 (ნაკეცის ცვლილება) = ±0.58.ვერტიკალური წერტილოვანი ხაზი მიუთითებს p მნიშვნელობა = 0.05.შავი წერტილები წარმოადგენს არასამიზნე sgRNA-ს (აღნიშნულია როგორც NC).წითელი წერტილები არის sgRNA-ები, რომლებიც მიმართულია DARS-AS1-ზე.ლურჯი წერტილები არის sgRNA-ები, რომლებიც მიზნად ისახავს LINC00205, ადრე აღწერილი ონკოგენური lncRNA.fold ცვლილება = (ნორმალიზებული კითხვა, დღე 17)/(ნორმალიზებული კითხვა, დღე 0).c DARS-AS1 sgRNA ბლოკირებამ შეაფერხა უჯრედების ზრდა.შეცდომის ზოლები წარმოადგენს სამი ექსპერიმენტის ± სტანდარტულ გადახრას.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტი.d DARS-AS1 გამოხატულება სიმსივნეებში (TCGA მონაცემთა ნაკრები).em DARS-AS1-ის გამოხატვა დაწყვილებულ ნორმალურ და სიმსივნურ ნიმუშებში პაციენტებიდან BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP და COAD, შესაბამისად (TCGA მონაცემთა ნაკრები).p-მნიშვნელობები მიღებულ იქნა დაწყვილებული ორკუდიანი სტუდენტური t-ტესტის გამოყენებით.
პლაზმიდის აგებისა და ლენტივირუსის შეფუთვის შემდეგ, ჩვენ გადავიყვანეთ dCas9-SW620 კოლორექტალური კიბოს უჯრედის ხაზი ზემოთ მოცემულ ბიბლიოთეკაში ოთხი დამოუკიდებელი ინფექციის ექსპერიმენტში.ინფექციის სიმრავლე (MOI) ამ ინფექციებისთვის იყო 0.1-0.3, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ თითოეული უჯრედის ტრანსფექტირება შესაძლებელია მხოლოდ ერთი sgRNA.ინ ვიტრო კულტურის 18 დღის შემდეგ, სამიზნე sgRNA-ების გამდიდრების პროფილი შემცირდა ან გაიზარდა სკრინინგის შემდეგ, ხოლო არამიზნობრივი საკონტროლო ოლიგონუკლეოტიდების რაოდენობა დარჩა შედარებით უცვლელი წინა სკრინინგის პროფილთან შედარებით, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ჩვენს სამიზნეს აქვს მაღალი სკრინინგის სპეციფიკა. ბიბლიოთეკა.ბრინჯი.1ბ და დამატებითი ცხრილი 1). LINC00205, რომელიც ადრე იყო მოხსენებული, რომ ხელს უწყობს ფილტვის კიბოს და ღვიძლის კიბოს პროგრესირებას58,59,60, იქნა სკრინინგი (log2 (ნაკეცის შეცვლა) < -0.58, p მნიშვნელობა <0.05), რაც ადასტურებს ამ სკრინინგის სანდოობას (ნახ. 1b). LINC00205, რომელიც ადრე იყო მოხსენებული, რომ ხელს უწყობს ფილტვის კიბოს და ღვიძლის კიბოს პროგრესირებას58,59,60, იქნა სკრინინგი (log2 (ნაკეცის შეცვლა) < -0.58, p მნიშვნელობა <0.05), რაც ადასტურებს ამ სკრინინგის სანდოობას (ნახ. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию лечих и для рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, вераго 5 значение p <0,58. 1ბ). LINC00205, რომელიც ადრე იყო მოხსენებული, რომ ხელს უწყობს ფილტვის კიბოს და ღვიძლის კიბოს პროგრესირებას58,59,60, გამორიცხული იყო (log2 (გამრავლებული ცვლილება) <-0,58, p-მნიშვნელობა <0,05), რაც ადასტურებს ამ სკრინინგის სიმტკიცეს (ნახ. 1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию надежния рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-მნიშვნელობა), (p-მნიშვნელობა) <0, 1ბ). LINC00205, რომელიც ადრე იყო მოხსენებული, რომ ხელს უწყობს ფილტვის და ღვიძლის კიბოს პროგრესირებას58,59,60, გამოირიცხა (log2 (ნაკეც ცვლილება) <-0.58, p-მნიშვნელობა <0.05), რაც ადასტურებს ამ სკრინინგის სიმტკიცეს (ნახ. .1b).
ყველა შემოწმებულ lncRNA-ს შორის, DARS-AS1 ასევე იყო სკრინინგი, სადაც სამი მონათესავე sgRNA ოლიგონუკლეოტიდი მნიშვნელოვნად შემცირდა კულტურის 18 დღის შემდეგ, რაც ვარაუდობს, რომ ამ lncRNA-ს დაცემამ გამოიწვია კიბოს პროლიფერაციის შემცირება (ნახ. 1b).ეს შედეგი შემდგომში მხარდაჭერილი იყო კოლორექტალური კიბოს უჯრედების MTS ანალიზმა, რომელიც აჩვენა, რომ DARS-AS1 ნოკდაუნის უჯრედების ზრდის ტემპი მხოლოდ განახევრდა საკონტროლო უჯრედებთან შედარებით (სურათი 1c) და შეესაბამებოდა რამდენიმე სხვა ტიპის კიბოს წინა ანგარიშებს.: თირკმელების გამწმენდი კიბო, ფარისებრი ჯირკვლის კიბო და ფილტვის არაწვრილუჯრედოვანი კიბო51,52,53,55.თუმცა, მისი ფუნქცია და მოლეკულური მექანიზმები კოლორექტალური კიბოს დროს შეუსწავლელი რჩება.ამიტომ, ჩვენ ავირჩიეთ ეს lncRNA შემდგომი კვლევისთვის.
პაციენტებში DARS-AS1 ექსპრესიის შესასწავლად, ჩვენ ყოვლისმომცველი გავაანალიზეთ 10,327 სიმსივნის ნიმუში კიბოს გენომის ატლასის (TCGA) პროექტისგან.ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ DARS-AS1 ფართოდ არის გამოხატული და მნიშვნელოვნად რეგულირდება ჯანმრთელ უჯრედებში სხვადასხვა სიმსივნეებში, მათ შორის მსხვილი ნაწლავის ადენოკარცინომა (COAD), თირკმლის გამჭვირვალე უჯრედული კარცინომა (KIRC) და თირკმლის პაპილარული უჯრედის კარცინომა (KIRP)..ძალიან ცოტა (ნახ. 1დ და დამატებითი ნახ. 1ა, ბ). დაწყვილებული ჯანსაღი/სიმსივნური ნიმუშების ანალიზმა კიდევ უფრო დაადასტურა DARS-AS1-ის მნიშვნელოვნად მაღალი გამოხატულება შარდის ბუშტის უროთელური კარცინომის (BLCA), თირკმლის თირკმლის გამჭვირვალე უჯრედული კარცინომის (KIRC), პროსტატის ადენოკარცინომა (PRAD), ფილტვის ბრტყელუჯრედოვანი კარცინომა (LUSC) სიმსივნეებში. საშვილოსნოს კორპუსის ენდომეტრიუმის კარცინომა (UCEC), ფილტვის ადენოკარცინომა (LUAD), ღვიძლის ჰეპატოცელულური კარცინომა (LIHC), თირკმლის თირკმლის პაპილარული უჯრედის კარცინომა (KIRP) და მსხვილი ნაწლავის ადენოკარცინომა (COAD) (p მნიშვნელობა < 0.05) (ნახ. 1e–m) . დაწყვილებული ჯანსაღი/სიმსივნური ნიმუშების ანალიზმა კიდევ უფრო დაადასტურა DARS-AS1-ის მნიშვნელოვნად მაღალი გამოხატულება შარდის ბუშტის უროთელური კარცინომის (BLCA), თირკმლის თირკმლის გამჭვირვალე უჯრედული კარცინომის (KIRC), პროსტატის ადენოკარცინომა (PRAD), ფილტვის ბრტყელუჯრედოვანი კარცინომა (LUSC) სიმსივნეებში. საშვილოსნოს კორპუსის ენდომეტრიუმის კარცინომა (UCEC), ფილტვის ადენოკარცინომა (LUAD), ღვიძლის ჰეპატოცელულური კარცინომა (LIHC), თირკმლის თირკმლის პაპილარული უჯრედის კარცინომა (KIRP) და მსხვილი ნაწლავის ადენოკარცინომა (COAD) (p მნიშვნელობა < 0.05) (ნახ. 1e–m) .დაწყვილებული ჯანსაღი/სიმსივნური ნიმუშების ანალიზმა ასევე დაადასტურა DARS-AS1-ის მნიშვნელოვნად მაღალი გამოხატულება შარდის ბუშტის უროთელიალურ კარცინომაში (BLCA), თირკმელებისა და თირკმლის უჯრედოვანი კარცინომა (KIRC), პროსტატის ადენოკარცინომა (PRAD), ფილტვის ბრტყელუჯრედოვანი კარცინომა (LUSC)., კარცინომა эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), პაპილლარნო-კლოტური კარცინომა პოчки (KIRP) და ადენოკარცინომა ტოლსტოი, (0) (p. მ) . საშვილოსნოს კორპუსის ენდომეტრიუმის კარცინომა (UCEC), ფილტვის ადენოკარცინომა (LUAD), ღვიძლის ჰეპატოცელულური კარცინომა (LIHC), თირკმლის პაპილარული უჯრედის კარცინომა (KIRP) და მსხვილი ნაწლავის ადენოკარცინომა (COAD) (p მნიშვნელობა < 0.05) (ნახ. 1ე– მ) .. . <0.05) (图1e-m) .. (lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 更 高 表达 表达 内膜 癌 癌 （（（） 肺腺癌 （（肝肝 肝肝 细胞癌 细胞癌 （（（liHc癌 (კირპ) (კოად) (p 值<0.05) (图1e-m) .ჯანსაღი/სიმსივნური დაწყვილებული ნიმუშების ანალიზმა შემდგომში მხარი დაუჭირა DARS-AS1-ის როლს შარდის ბუშტის უროთელიალურ კარცინომაში (BLCA), გამჭვირვალე თირკმლის უჯრედულ კარცინომაში (KIRC), პროსტატის ადენოკარცინომა (PRAD) და ფილტვის ბრტყელუჯრედოვანი კარცინომა (LUSC).экспресия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарцином легкого (LUAD), gepatocellulyarnoy carcinome (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карцином (KIRP) და ადენოკარცინომე (p.CO.5.5) -მ). ექსპრესია საშვილოსნოს კორპუსის კარცინომაში (UCEC), ფილტვის ადენოკარცინომა (LUAD), ჰეპატოცელულარული კარცინომა (LIHC), თირკმლის პაპილარული უჯრედის კარცინომა (KIRP) და მსხვილი ნაწლავის ადენოკარცინომა (COAD) (p მნიშვნელობა <0.05) (სურათი 1e -m).ერთად აღებული, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ DARS-AS1 ფართოდ და ძალიან გამოხატულია სხვადასხვა კიბოს დროს.
იმის გამო, რომ DARS-AS1 და DARS (გენი, რომელიც აკოდირებს ანტისენსიურ ძაფს) იზიარებენ ერთნაირი პრომოტორს და განლაგებულია ერთმანეთის გვერდით, ჩვენ დავაპროექტეთ shRNA სპეციალურად DARS-AS1-ის დასამყარებლად, მაგრამ არა DARS-ის (დამატებითი ნახ. 2a,b და დამატებითი ცხრილი 2). .SW620-ის გარდა, ჩვენ ასევე გამოვიყენეთ DARS-AS1-ის მაღალი ექსპრესიის სამი სხვა უჯრედული ხაზი, რათა შეგვესწავლა shRNA ნოკდაუნის ეფექტურობა და ფუნქცია (დამატებითი ცხრილი 3).ჩვენმა შედეგებმა აჩვენა, რომ სამივე შემუშავებულმა shRNA-მ მიაღწია მინიმუმ 80% DARS-AS1 ნოკდაუნის ეფექტურობას მცირე ზეგავლენით DARS mRNA-ს რაოდენობაზე (დამატებითი ნახ. 2c-f).გარდა ამისა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ DARS-AS1 ნოკდაუნმა ამ shRNA-ებით მნიშვნელოვნად აფერხებდა უჯრედების ზრდას კოლორექტალური კიბოს უჯრედულ ხაზებში SW620 (49.7%) და HCT116 (27.7%), ძუძუს კიბოს უჯრედების MBA-MD-231 (53.4%).) და HepG2 ჰეპატომის უჯრედის ხაზი (92.7% შემცირება), ისევე როგორც მათი უნარი შექმნან დაუმაგრებელი სფეროები (საშუალო შემცირება ~50.8%, 44.6%, 40.7% და 75.7% უჯრედულ ხაზზე) (ნახ. 2a,b).SW620-ში, კოლონიების ფორმირების ანალიზის შედეგებმა დამატებით დაადასტურა, რომ DARS-AS1 shRNA მნიშვნელოვნად აფერხებს უჯრედების პროლიფერაციას საშუალოდ 69.6%-ით შემცირებით (ნახ. 2c).
საკონტროლო shRNA და DARS-AS1 shRNA-ს ეფექტი უჯრედების პროლიფერაციაზე (a) და სფეროიდების წარმოქმნაზე (b) SW620, HCT116, MBA-MD-231 და HepG2 უჯრედებში.c საკონტროლო shRNA და DARS-AS1 shRNA-ს ეფექტი SW620 უჯრედებში კოლონიების წარმოქმნაზე.უჯრედების პროლიფერაცია (d), სფეროიდების წარმოქმნა (e) და კოლონიის წარმოქმნა (f) SW620 უჯრედების ზედმეტად გამოხატული DARS-AS1.ნაჩვენები მონაცემები არის სამი ექსპერიმენტის საშუალო ± სტანდარტული გადახრა.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 და *** p ≤ 0,001 ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტით.
ფუნქციის დაკარგვის კვლევების შესავსებად, ჩვენ შევქმენით SW620 უჯრედები, რომლებიც ზედმეტად გამოხატავს DARS-AS1-ს (დამატებითი ნახ. 2გ).DARS-AS1-ის გადაჭარბებულმა გამოხატვამ მნიშვნელოვნად გაზარდა უჯრედების ზრდა (1.8-ჯერ), დაუმაგრებელი სფეროიდების წარმოქმნა (1.4-ჯერ) და კოლონიების წარმოქმნა (3.3-ჯერ) SW620 უჯრედებში (ნახ. 2d–f).ჩვენ დავადასტურეთ ეს შედეგი სხვა DARS-AS1 გამოხატული უჯრედის ხაზის, A549 გამოყენებით.ეს გაძლიერებული უჯრედების პროლიფერაცია DARS-AS1 გადაჭარბებული ექსპრესიის გამო შემდგომში დაფიქსირდა A549 უჯრედებში (დამატებითი სურ. 2h, i და დამატებითი ცხრილი 3).ერთად აღებული, ეს მოგება-დაკარგვის კვლევები აჩვენებს, რომ DARS-AS1 ხელს უწყობს კიბოს უჯრედების პროლიფერაციას in vitro.
იმ მექანიზმის შესასწავლად, რომლითაც DARS-AS1 არეგულირებს უჯრედების პროლიფერაციას, ჩვენ ჩავატარეთ რნმ-ის ჩამოსაშლელი ანალიზი მისი პოტენციური პროტეინთან დამაკავშირებელი პარტნიორების გამოსავლენად.RT-qPCR შედეგებმა აჩვენა, რომ DARS-AS1-ის დაახლოებით 86.2% მდებარეობს SW620 უჯრედების ციტოპლაზმაში (დამატებითი სურ. 3a).ინ ვიტრო ტრანსკრიბირებული ბიოტინილირებული DARS-AS1 ან ფსევდორნმ შემდეგ ინკუბირებული იყო SW620 უჯრედის ლიზატებით, რასაც მოჰყვა SDS-PAGE გამოყოფა.ვერცხლის შემდგომმა შეღებვამ აჩვენა, რომ განსხვავებული ზოლი (~38 kDa) მნიშვნელოვნად გამდიდრდა DARS-AS1 pull ნიმუშებში, მაგრამ არა მოჩვენებითი რნმ-ის ან მძივების ნიმუშებში (ნახ. 3a).ეს ზოლი იდენტიფიცირებული იყო, როგორც PKR გამააქტიურებელი პროტეინი (PACT) მასის სპექტრომეტრიით (MS) და შემდგომ დადასტურდა იმუნობლოტირებით SW620, HCT116 და HepG2 უჯრედულ ხაზებში (ნახ. 3a,b).DARS და მასთან დაკავშირებული PACT პროტეინების - PKR და TRBP - გამდიდრება ასევე გამოკვლეული იყო რნმ ანალიზის გამოყენებით Western blotting (WB).შედეგებმა აჩვენა, რომ პირდაპირი ურთიერთქმედება DARS-AS1 რნმ-სა და ამ სამ ცილას შორის არ იქნა ნაპოვნი (დამატებითი სურ. 3b).DARS-AS1-სა და PACT-ს შორის სპეციფიკური ურთიერთქმედება შემდგომში დადასტურდა რნმ-ის იმუნოპრეციპიტაციის (RIP) ანალიზით, რომელმაც აჩვენა, რომ DARS-AS1 მნიშვნელოვნად გამდიდრებული იყო ანტი-PACT ანტისხეულებით, მაგრამ არა სხვა საკონტროლო რნმ-ებით (სურათი 3c).იმის დასადგენად, ურთიერთქმედებს თუ არა DARS-AS1 უშუალოდ PACT-თან ნებისმიერი სხვა უჯრედული კომპონენტის არარსებობის შემთხვევაში, ჩატარდა ინ ვიტრო ბიოფენების ინტერფერომეტრია (BLI) ანალიზი გაწმენდილი PACT-ის გამოყენებით.ბიოტინით მარკირებული DARS-AS1 ან მოჩვენებითი რნმ იყო იმობილიზაცია სტრეპტავიდინის (SA) ბიოსენსორებზე და შემდეგ ინკუბირებული იყო კინეტიკური ბუფერში, რომელიც შეიცავს 1 μM PACT.აღსანიშნავია, რომ PACT მტკიცედ უკავშირდება DARS-AS1-ს (KD მნიშვნელობა ~26,9 ნმ), მაგრამ არა რნმ-ის იმიტაციას (სურათი 3d).ერთად აღებული, ეს შედეგები აჩვენებს პირდაპირ ურთიერთქმედებას და მაღალ კავშირს DARS-AS1-სა და PACT-ს შორის.
რნმ-ის მოზიდვის ანალიზმა გამოავლინა DARS-AS1 ურთიერთქმედება PACT-თან SW620 უჯრედებში.ზემოთ, დაკავშირებული ცილების ვერცხლის შეღებვა.ქვედა იმუნობლოტები ჩატარდა ანტი-PACT ანტისხეულით.b რნმ-ის ჩამოსაშლელი ანალიზი ჩატარდა HCT116 (ზედა) და HepG2 (ქვედა) უჯრედებში.PACT გამდიდრება გამოვლინდა იმუნობლოტირებით.cRNA იმუნოპრეციპიტაციის (RIP) ანალიზი ჩატარდა SW620 უჯრედებში მითითებული ანტისხეულების გამოყენებით.d PACT დამაკავშირებელი მრუდები სრულმეტრაჟიან DARS-AS1-თან ან საკონტროლო რნმ-თან მიღებულ იქნა ბიოფენების ინტერფერომეტრიის (BLI) გამოყენებით.რნმ იყო იმობილიზაცია სტრეპტავიდინის ბიოსენსორზე.ასოციაციის გასაზომად გამოყენებული იყო 1 μM PACT.e RNA pull-ის ანალიზი ჩატარდა ბიოტინილირებული სრულმეტრაჟიანი DARS-AS1 ან შეკვეცილი (ზედა) გამოყენებით.იმუნობლოტი აჩვენებს PACT მიღებულ (ქვემოთ).f გაწმენდილი დროშის მქონე PACT ინკუბირებული იყო ბიოტინილირებული სრულმეტრაჟიანი DARS-AS1-ით ან შეკვეცილი (როგორც e) in vitro RIP ანალიზისთვის.ამოღებული რნმ დამოწმებული იყო RT-qPCR-ით.g სხვადასხვა რნმ-ის ფრაგმენტების ფარდობითი აფინურობა PACT-თან მიღებულ იქნა ბიოფენების ინტერფერომეტრიის გამოყენებით.ანალიზისთვის გამოყენებული იქნა 100 ნმ რნმ და 1 μM RAST.h in vitro RIP ანალიზები ჩატარდა გაწმენდილი უცვლელი ან შეკვეცილი ეტიკეტირებული PACT-ის გამოყენებით.ამოღებული რნმ დამოწმებული იყო RT-qPCR-ით.i SW620 უჯრედების ზრდის ტემპი, რომლებიც ზედმეტად გამოხატავენ DARS-AS1, PACT ან ორივე ერთად.j სრულმეტრაჟიანი ან შეკვეცილი DARS-AS1-ის ზედმეტად გამოხატვას SW620 უჯრედებში განსხვავებული გავლენა ჰქონდა უჯრედების ზრდაზე.k აპოპტოზი გამოვლინდა იმუნობლოტირებით ანტი-PARP ანტისხეულით.l DARS-AS1-ის ნოკაუტი იწვევს SW620 უჯრედების აპოპტოზს, როგორც ნაჩვენებია ნაკადის ციტომეტრიით.ნაჩვენები მონაცემები არის სამი ექსპერიმენტის საშუალო ± სტანდარტული გადახრა. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, ორკუდიანი სტუდენტის t ტესტით. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, ორკუდიანი სტუდენტის t ტესტით. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტით. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტით.
შემდეგ ჩვენ შევქმენით სამი ბიოტინილირებული DARS-AS1 რნმ ფრაგმენტი ინ ვიტრო ტრანსკრიპციით, რათა განვსაზღვროთ DARS-AS1 რეგიონი, რომელიც საჭიროა PACT ასოციაციისთვის (სურათი 3e).რნმ-ის ანალიზის შედეგებმა აჩვენა, რომ თითოეულ ფრაგმენტს შეეძლო ურთიერთქმედება PACT-თან, მაგრამ 3'-ტერმინალური რეგიონი (384-768 ნუკლეოტიდი მარკირებული A3) აჩვენებდა 1-384-ზე მეტ ნუკლეოტიდს მარკირებული A1) (ნახ. 3e).მსგავსი შედეგები დაფიქსირდა in vitro RIP ანალიზში რეკომბინანტული PACT-ის გამოყენებით (სურათი 3f).ამ შედეგების შესაბამისად, იმობილიზებული რნმ-ის ფრაგმენტების PACT-თან დაკავშირების ექსპერიმენტებმა BLI-ს გამოყენებით ასევე აჩვენა, რომ PACT-ს აქვს უფრო მაღალი მიდრეკილება A3-თან (384–768 ნტ) (KD მნიშვნელობა დაახლოებით 94,6 ნმ), ხოლო სხვა უბნებთან თითქმის არანაირი კავშირი.(ნახ. 3დ).
ჩვენ ასევე განვიხილეთ ასოცირებული სავალდებულო რეგიონები PACT-ში.PACT შეიცავს სამ ფუნქციურ დომენს, რომელთაგან ორი არის შენახული ორჯაჭვიანი რნმ-შემაკავშირებელი დომენები (dsRBD) და მესამე დომენი (დანიშნული D3), რომელიც მოქმედებს როგორც ცილოვანი ურთიერთქმედების აქტივატორი.თითოეული დომენის lncRNA დამაკავშირებელი შესაძლებლობების შესამოწმებლად, ჩვენ შევქმენით სამი მუტაცია, რომლებმაც ამოიღეს სამი დომენი და ჩავატარეთ RIP ანალიზი in vitro.ჩვენმა შედეგებმა აჩვენა, რომ PACT-ის მესამე დომენის (D3) წაშლა მნიშვნელოვნად ამცირებს მის ურთიერთქმედებას DARS-AS1-თან (0,11-ჯერ, ხელუხლებელი PACT-თან შედარებით) დანარჩენ ორ მუტაციასთან შედარებით (ნახ. 3სთ), ნაჩვენები იყო, რომ გამოშვება D3-ის ურთიერთქმედება DARS-თან.-AC1.ერთად აღებული, ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ DARS-AS1-სა და PACT-ს შორის ურთიერთქმედება შეიძლება მოხდეს ძირითადად DARS-AS1-ის 3' ბოლოს და PACT-ის D3 დომენის მეშვეობით.
ჩვენ აღვნიშნეთ, რომ DARS-AS1-ს არ ჰქონდა გავლენა PACT გამოხატვაზე და PACT-ს არ ჰქონდა გავლენა DARS-AS1-ზე (დამატებითი სურ. 3c).შემდეგ ჩვენ გამოვიკვლიეთ PACT დაცემის ეფექტი უჯრედების ზრდაზე.DARS-AS1-ისგან განსხვავებით, ფარდობითი უჯრედები იზრდებოდა 1.5-3-ჯერ უფრო სწრაფად, როდესაც PACT ჩამოინგრა (დამატებითი ნახ. 3d).კოლონიების ფორმირების ანალიზის შედეგებმა აჩვენა, რომ უჯრედებმა შექმნეს 2-3-ჯერადი კოლონიები PACT-ით shRNA დამუშავების შემდეგ (დამატებითი სურ. 3e).იმის შესამოწმებლად, არეგულირებს თუ არა DARS-AS1 უჯრედების პროლიფერაციას PACT-ის მეშვეობით, ჩვენ გენერირებულია SW620 უჯრედები, რომლებიც ზედმეტად გამოხატავს PACT-ს, DARS-AS1-ს ან ორივეს.PACT-ის გადაჭარბებულმა გამოხატვამ აჩვენა უჯრედების პროლიფერაციის მნიშვნელოვანი დათრგუნვა (სურათი 3i).მიუხედავად იმისა, რომ DARS-AS1 ჭარბი გამოხატვა თავისთავად მნიშვნელოვნად უწყობს ხელს უჯრედების პროლიფერაციას, არ იყო მნიშვნელოვანი განსხვავება უჯრედების ზრდის ტემპში, რომლებიც ზედმეტად გამოხატავდნენ DARS-AS1 და PACT.ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ PACT-მა შეიძლება დაუპირისპირდეს DARS-AS1-ის ჭარბი გამოხატულებით გამოწვეულ გაზრდილ პროლიფერაციას.
ვინაიდან DARS-AS1-ის სხვადასხვა რეგიონს აქვს PACT-დაკავშირების განსხვავებული უნარი, ჩვენ გამოვიკვლიეთ მათი შედარებითი გავლენა უჯრედების პროლიფერაციაზე DARS-AS1 ფრაგმენტების სხვადასხვა გადაჭარბებული ექსპრესიით.დანარჩენ ორ ფრაგმენტთან შედარებით, DARS-AS1 იყო ზედმეტად გამოხატული 3' ბოლოს (384-768 ნტ), PACT-თან დაკავშირებული მთავარი რეგიონი DARS-AS1-ში, რომელსაც გააჩნდა უჯრედების პროლიფერაციის სტიმულირების ყველაზე მაღალი უნარი (ნახ. 3j).ეს შედეგები მიუთითებს დადებით კორელაციაზე DARS-AS1-ის დამაკავშირებელ შესაძლებლობებსა და ბიოლოგიურ ფუნქციას შორის.
ცნობილია, რომ PACT არის პრო-აპოპტოზური ცილა19.ამიტომ, ჩვენ გამოვიკვლიეთ DARS-AS1-ის ეფექტი აპოპტოზზე.როგორც მოსალოდნელი იყო, DARS-AS1 ნოკდაუნმა მნიშვნელოვნად გაზარდა PARP გაყოფა SW620 უჯრედებში და გაზარდა ანექსინ V-დადებითი უჯრედების პროპორცია SW620, HCT116, HepG2 და MBA-MD-231 უჯრედულ ხაზებში (ნახ. 3k).3).3f–h), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ DARS-AS1-ის ანტიაპოპტოზური ეფექტი კიბოს უჯრედებში ეწინააღმდეგება PACT-ის აპოპტოზის გამომწვევ ფუნქციას.ერთად აღებული, ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ DARS-AS1 ონკოგენური ფუნქციის მექანიზმი შეიძლება იყოს PACT ფუნქციის ინჰიბირება.
შემდეგი, ჩვენ გამოვიკვლიეთ DARS-AS1-PACT ასოციაციის ფუნქციური შედეგები.ცნობილია, რომ PACT ააქტიურებს PKR-ს პირდაპირი ურთიერთქმედების გზით, რაც შემდგომში აძლიერებს eIF2α ფოსფორილირებას, რაც იწვევს ტრანსლაციურ დელეციას და აპოპტოზს17.პირველ რიგში, ჩვენ გამოვიკვლიეთ, მოქმედებს თუ არა DARS-AS1 PACT-ისა და PKR-ის უჯრედულ ლოკალიზაციაზე.კონფოკალური ფლუორესცენციული მიკროსკოპია აჩვენა, რომ PACT და PKR ძალიან კოლოკალიზებულია SW620 უჯრედებში, Pearson-ის საშუალო კორელაციის კოეფიციენტით 0,72.იმავდროულად, DARS-AS1 გადაჭარბებულმა გამოხატვამ მნიშვნელოვნად შეამცირა PACT და PKR კოლოკალიზაცია (პირსონის კორელაციის საშუალო კოეფიციენტი 0.61) (სურათი 4a).გამოსაკვლევად შეეძლო თუ არა DARS-AS1-ს PACT-PKR ურთიერთქმედების მოდულირება, ჩვენ ჩავატარეთ კო-იმუნოპრეციპიტაციის (co-IP) ანალიზი ანტი-PACT ანტისხეულებით SW620 უჯრედების ლიზატებში.PKR ძალიან გამდიდრებული იყო ანტი-PACT-ით საკონტროლო უჯრედებში, ხოლო PKR-ის აღდგენა მნიშვნელოვნად შემცირდა ლიზატებში DARS-AS1-ის ზედმეტად გამოხატული უჯრედებიდან (ნახ. 4b).გასუფთავებული ეტიკეტირებული PACT და PKR გამოიყენებოდა ინ ვიტრო ცილებთან შეკავშირების ანალიზებისთვის.შესაბამისად, მათ, ვინც უზრუნველყოფდა DARS-AS1-ს, მაგრამ არა საკონტროლო რნმ-ს, აჩვენეს დათრგუნული PACT-PKR ურთიერთქმედება (სურათი 4c).ყველა შედეგმა აჩვენა, რომ DARS-AS1-მა შეაფერხა PACT და PKR კომუნიკაცია.
PACT-ისა და PKR-ის ერთობლივი ლოკალიზაცია საკონტროლო უჯრედებში ან DARS-AS1-ის ზედმეტად გამოხატულ უჯრედებში დაფიქსირდა კონფოკალური ფლუორესცენტური მიკროსკოპის გამოყენებით.ბირთვები შეღებილი იყო DAPI-ით.სტატისტიკური შედეგები იქნა მიღებული 16 ფოტოსურათიდან.b Co-immunoprecipitation (co-IP) ანტი-PACT ანტისხეულების გამოყენებით საკონტროლო SW620 უჯრედების ან უჯრედების ლიზატებში, რომლებიც ჭარბად გამოხატავენ DARS-AS1.c ეტიკეტირებული PACT, გაწმენდილი PKR და ტრანსკრიბირებული in vitro DARS-AS1 ან იმიტირებული რნმ ინკუბირებული იყო ინ ვიტრო ცილებთან შეკავშირების ანალიზისთვის.დროშის საწინააღმდეგო ანტისხეულები გამოიყენებოდა იმუნოპრეციპიტაციისთვის.d იმუნობლოტები მითითებული ანტისხეულებით ჩატარდა SW620 და HCT116 უჯრედებში, რომლებიც ტრანსფექციულ იქნა საკონტროლო shRNA ან DARS-AS1-shRNA, რასაც მოჰყვა შრატის შიმშილი.e DARS-AS1 გამოხატვის დონემ შეცვალა უჯრედების მგრძნობელობა თაფსიგარგინის მიმართ.SW620 უჯრედები გადაიზარდა DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 გადაჭარბებული გამოხატვის პლაზმიდით ან საკონტროლო პლაზმიდით.უჯრედები დამუშავდა თაფსიგარგინით 48 საათის განმავლობაში და უჯრედის სიცოცხლისუნარიანობა განისაზღვრა MTS რეაგენტის გამოყენებით.f ინ ვიტრო ტრანსკრიბირებული DARS-AS1 ან მოჩვენებითი რნმ და გაწმენდილი PACT გამოიყენებოდა ინ ვიტრო აქტივაციის ანალიზისა და იმუნობლოტის გამოვლენისთვის.g იმუნობლოტები ამ ანტისხეულების გამოყენებით შესრულდა SW620-ctrl უჯრედებზე (მარცხნივ) ან უჯრედებზე, რომლებიც ჭარბად გამოხატავენ PKR მუტანტებს (მარჯვნივ).ეს უჯრედები შემდეგ გადაიზარდა საკონტროლო shRNA ან DARS-AS1-shRNA, რასაც მოჰყვა შრატის შიმშილი.h ნაკადის ციტომეტრიამ აჩვენა, რომ მუტანტის PKR-ის ინაქტივაცია ანაზღაურებს DARS-AS1-ით გამოწვეული აპოპტოზს SW620 უჯრედებში.i იმუნობლოტები მითითებული ანტისხეულებით ჩატარდა SW620 (მარცხნივ) ან HCT116 (მარჯვნივ) უჯრედებში.საკონტროლო shRNA-ით ან DARS-AS1 shRNA-ით ტრანსინფიცირებული უჯრედები შრატში არ არის და დამატებულია 100 ნმ PKR C16 ინჰიბიტორით ან DMSO.მასშტაბის ზოლი = 5 μm.ნაჩვენები მონაცემები არის სამი ექსპერიმენტის საშუალო ± სტანდარტული გადახრა.* p ≤ 0.05 ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტი.
ზოგადად მიჩნეულია, რომ როგორც კი PACT ურთიერთქმედებს PKR17-თან, PKR ფოსფორილირება Thr451-ზე შეიძლება იყოს გამოწვეული.ჩვენმა შედეგებმა აჩვენა, რომ PKR ფოსფორილირების დონე მნიშვნელოვნად ამაღლებული იყო DARS-AS1 ნოკდაუნის უჯრედებში შრატის შიმშილის შემდეგ (ნახ. 4d და დამატებითი სურ. 4a).შესაბამისად, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ eIF2α, მთავარი PKR სუბსტრატის ფოსფორილირება ასევე მნიშვნელოვნად გაიზარდა DARS-AS1 shRNA-მ (ნახ. 4d და დამატებითი ნახ. 4a).თაფსიგარგინი არის ER სტრესორი, რომელიც იწვევს ER-ის გამოყოფას Ca2+.ცნობილია, რომ თაფსიგარგინით მკურნალობა იწვევს PACT-ის ექსპრესიას და აქტივაციას, რომელიც შემდგომში ურთიერთქმედებს და ააქტიურებს PKR-ს, რაც იწვევს აპოპტოზს eIF2α ფოსფორილირების გაზრდით 18,61 .აქ ჩვენ გამოვიყენეთ თაფსიგარგინი, როგორც PACT/PKR გზის სტიმულატორი, რათა გამოგვეკვლია, შეუძლია თუ არა DARS-AS1-ს დაეხმაროს უჯრედებს სტრესის დაძლევაში PACT/PKR გზის ინჰიბირებით.ჩვენ დავაკვირდით, რომ DARS-AS1 გამოხატვის დონე დადებითად იყო დაკავშირებული უჯრედის წინააღმდეგობასთან თაფსიგარგინის მიმართ.SW620 უჯრედები, რომლებიც ზედმეტად გამოხატავდნენ DARS-AS1-ს, უკეთესად გადარჩნენ თაფსიგარგინით მკურნალობისას, ხოლო DARS-AS1 ნოკდაუნის მქონე უჯრედები უფრო მგრძნობიარე გახდა (ნახ. 4e).ამ შედეგების შესაბამისად, DARS-AS1-ის გადაჭარბებული გამოხატულება ამცირებს თაფსიგარგინით გამოწვეული PKR ფოსფორილირებას (დამატებითი სურ. 4b).ამის საპირისპიროდ, თაფსიგარგინით მკურნალობის შემდეგ, PKR და eIF2α უფრო მაღალი ხარისხით იყო ფოსფორილირებული DARS-AS1 ნოკდაუნის უჯრედებში საკონტროლო უჯრედებთან შედარებით (დამატებითი სურ. 4b).საინტერესოა, რომ თაფსიგარგინი იწვევდა DARS-AS1 ექსპრესიას დოზადამოკიდებული ფორმით, რაც შეიძლება მიუთითებდეს DARS-AS1-ის ანტისტრესულ ფუნქციაზე (დამატებითი სურ. 4c).გარდა ამისა, ჩვენ ჩავატარეთ ინ ვიტრო აქტივაციის ანალიზები ამ დაკვირვებების დასადასტურებლად.მოკლედ, PKR გაიწმინდა უჯრედის ლიზატებისგან ანტი-PKR ანტისხეულის გამოყენებით, შემდეგ ინკუბირებული იქნა რეკომბინანტული PACT-ით და DARS-AS1 ტრანსკრიბირებული in vitro.ფერმენტული რეაქციის შემდეგ, ფოსფო-PKR გამოვლინდა WB-ის გამოყენებით.ჩვენმა შედეგებმა აჩვენა, რომ PKR ფოსფორილირება მნიშვნელოვნად დათრგუნული იყო DARS-AS1-ით, მაგრამ არა საკონტროლო რნმ-ით (სურათი 4f).ეს in vitro და in vivo შედეგები ვარაუდობს, რომ DARS-AS1 აინჰიბირებს PACT შუამავლობით PKR აქტივაციას.ამავდროულად, ჩვენ ასევე დავაფიქსირეთ PACT აღდგენის შემცირება DARS-AS1-ის თანდასწრებით (სურათი 4f).ეს შედეგი შეესაბამება ცილებთან შეკავშირების ანალიზის in vitro შედეგებს (სურათი 4c) და კვლავ ასახავს DARS-AS1-ის ბლოკირების ფუნქციას PACT-PKR ასოციაციისთვის.
Ser246 და Ser287 PACT-ის D3 დომენში საჭიროა PKR გააქტიურებისთვის უჯრედული სტრესის პირობებში.ორი სერინის ნარჩენების ჩანაცვლებამ ალანინით მისცა მუტანტის PACT (mutD), რომელმაც გაააქტიურა PKR სტრესის არარსებობის შემთხვევაში და ალანინით (mutA) ჩანაცვლებამ შეცვალა პროტოკოლი.მას შემდეგ, რაც ჩვენ ვაჩვენეთ ამ დომენის მნიშვნელობა DARS-AS1-თან უშუალო კავშირში, ჩვენ შევქმენით ეს ორი PACT მუტანტი, რათა შეგვემოწმებინა, შეიძლება თუ არა ეს ნარჩენები ჩართული იყოს DARS-AS1-თან ურთიერთქმედებაში.საინტერესოა, რომ ორივე მუტანტმა დაკარგა DARS-AS1-თან შეკავშირების უნარი (დამატებითი სურ. 4d), რაც ვარაუდობს, რომ PACT ცილის სრული სტრუქტურა შეიძლება საჭირო გახდეს DARS-AS1-თან ეფექტური ურთიერთქმედებისთვის.
გარდა ამისა, ჩვენი შედეგები ასევე ვარაუდობს, რომ DARS-AS1-shRNA გამოწვეული უჯრედების პროლიფერაციის დათრგუნვა შეიძლება ნაწილობრივ აღდგეს დომინანტური უარყოფითი PACT მუტანტის (PACTmutA) ან დომინანტური უარყოფითი PKR მუტანტის (PKRmut) გადაჭარბებული გამოხატვით (დამატებითი ნახ. 4e. e).დომინანტურ-უარყოფითი PKR მუტანტების ზედმეტად გამოხატვა ამცირებს PKR ფოსფორილირებას, რომელიც გამოწვეულია DARS-AS1 ნოკდაუნით, ისევე როგორც eIF2α ფოსფორილირებით შრატმოკლებულ უჯრედებში (ნახ. 4გ).რაც უფრო მნიშვნელოვანია, DARS-AS1 ნოკდაუნით გამოწვეული აპოპტოზური უჯრედების პროპორცია ასევე შემცირდა PKRmut-ის ზედმეტად გამოხატულ უჯრედებში (ნახ. 4h და დამატებითი ნახ. 4გ).PKR კინაზას აქტივობის დათრგუნვა ასევე აზიანებს DARS-AS1 ფუნქციას, რადგან შედეგებმა აჩვენა, რომ DARS-AS1-ის დაცემა იშვიათად იწვევს PKR და eIF2α ფოსფორილირებას, როდესაც უჯრედები მკურნალობდნენ PKR-სპეციფიკური C16 ინჰიბიტორებით (ნახ. 4i და დამატებითი სურ.4h).).ერთად აღებული, ჩვენი შედეგები ვარაუდობს, რომ DARS-AS1 ხელს უწყობს უჯრედების პროლიფერაციას, ნაწილობრივ მაინც, PACT შუამავლობით PKR აქტივაციის ინჰიბირებით.
DARS-AS1-ის როლის შემდგომი შესწავლისთვის სიმსივნურ გენეზში, ჩვენ ჩავატარეთ in vivo ექსპერიმენტები თაგვის ქსენოტრანფტის მოდელის გამოყენებით. შედეგები აჩვენებს, რომ DARS-AS1-ის ნოკდაუნმა მკვეთრად შეამცირა სიმსივნის ზრდა თაგვებში (p მნიშვნელობა <0.0001) (ნახ. 5a). შედეგები აჩვენებს, რომ DARS-AS1-ის ნოკდაუნმა მკვეთრად შეამცირა სიმსივნის ზრდა თაგვებში (p მნიშვნელობა <0.0001) (ნახ. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (მნიშვნელობა p <0,0001) (рис. 5а). შედეგები აჩვენებს, რომ DARS-AS1 ნოკდაუნი მკვეთრად ამცირებს სიმსივნის ზრდას თაგვებში (p მნიშვნელობა <0.0001) (სურათი 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значајно снижает рост опухоли во мышей (მნიშვნელობა р <0,0001) (рис. 5а). შედეგებმა აჩვენა, რომ DARS-AS1 ნოკდაუნმა მნიშვნელოვნად შეამცირა სიმსივნის ზრდა თაგვებში (p მნიშვნელობა <0.0001) (სურათი 5a).ამრიგად, DARS-AS1 ნოკდაუნის ჯგუფში, დაფიქსირდა სიმსივნის საშუალო მოცულობის მნიშვნელოვანი შემცირება დაახლოებით 72.9%-ით და საშუალო სიმსივნის მასის დაახლოებით 87.8%-ით (სურათი 5b-d).ეს შედეგები მტკიცედ ვარაუდობს, რომ DARS-AS1-ს შეუძლია მნიშვნელოვნად შეუწყოს ხელი სიმსივნის ზრდას in vivo.
რეკლამის DARS-AS1 ნოკდაუნის ეფექტები კოლორექტალურ ონკოგენეზზე შიშველ თაგვებში.ნაჩვენებია ზრდის მრუდები (a), სიმსივნის ზომა (b), წონა (c) და სიმსივნის გამოსახულებები (d).შეცდომის ზოლები წარმოადგენს ±SEM. n = 10. ****p < 0.0001, ორმხრივი სტუდენტური t ტესტით. n = 10. ****p < 0.0001, ორმხრივი სტუდენტური t ტესტით. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტი.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტი.e Kaplan-Meier-მა გააანალიზა კორელაცია DARS-AS1 გამოხატვის დონესა და საერთო გადარჩენას შორის პაციენტებში UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM და LGG.DARS-AS1 ექსპრესიის მაღალი დონე პაციენტებში იყო ზედა 50%-ში;DARS-AS1 გამოხატვის დაბალი დონე პაციენტებში იყო ქვედა 50%.p-მნიშვნელობები განისაზღვრა ლოგის რანგის ტესტის გამოყენებით.f შემოთავაზებული მოდელი, რომელშიც DARS-AS1 არეგულირებს PACT-PKR გზას და სიმსივნის ზრდას.
DARS-AS1-ის კლინიკური ზემოქმედების უკეთ გასაგებად, ჩვენ გამოვიკვლიეთ კორელაცია მის გამოხატვასა და პაციენტის გადარჩენას შორის.TCGA მონაცემთა ნაკრების გაანალიზებით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ უფრო მაღალი DARS-AS1 გამოხატულება ასოცირდება უვეალურ მელანომასთან (UVM), თირკმლის ქრომოფობიასთან (KICH), თირკმლის პაპილარული უჯრედის კარცინომასთან (KIRP), მეზოთელიომასთან (MESO), მულტიპლექსთან.დაბალი გადარჩენა მნიშვნელოვნად იყო დაკავშირებული გლიობლასტომის მორფოზთან (GBM) და დაბალი ხარისხის ტვინის გლიომასთან (LGG) (სურათი 5e).ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ DARS-AS1 შეიძლება ითამაშოს მნიშვნელოვანი როლი კლინიკური სიმსივნის პროგრესირებაში და შეიძლება იყოს პოტენციური პროგნოზირებადი ბიომარკერი მრავალი კიბოს დროს.
ამ კვლევაში, ფართომასშტაბიანი CRISPRi ფუნქციური სკრინინგის გამოყენებით, ჩვენ დავადგინეთ, რომ DARS-AS1 lncRNA გადალახავს კიბოს უჯრედების სტრესს ორი ძირითადი სტრესის რეაგირების, PACT და PKR რეგულირებით.უშუალოდ PACT-თან ურთიერთქმედებით, DARS-AS1 აფერხებდა PACT შუამავლობით PKR აქტივაციას, რითაც ხელს უშლის აპოპტოზურ უჯრედების სიკვდილს და ხელს უწყობს უჯრედების პროლიფერაციას (ნახ. 5f).DARS-AS1-ის ზერეგულაცია დაფიქსირდა კიბოს მრავალ ტიპში, რაც ვარაუდობს, რომ მისი ფუნქცია, რომელიც ხელს უწყობს კიბოს უჯრედების გადარჩენას სტრესულ პირობებში, შეიძლება ფართოდ იყოს გამოყენებული კიბოს მრავალი ტიპისთვის.
PACT იდენტიფიცირებულია, როგორც PKR აქტივატორი ცილა და PACT შუამავლობით PKR აქტივაცია მნიშვნელოვან როლს ასრულებს სტრესის პასუხებში ტრანსკრიპციის, ტრანსლაციის, აპოპტოზის და სხვა მნიშვნელოვანი უჯრედული პროცესების რეგულირებით62.ათწლეულების მანძილზე ცდილობდნენ გაეგოთ PACT-PKR კასკადის კიბოს სპეციფიკური რეგულირება.აქ ჩვენმა კვლევამ გამოავლინა კიბოს უჯრედებში PACT-PKR-ის რეგულირების განსხვავებული მექანიზმი უჯრედული lncRNA DARS-AS1-ის მეშვეობით, რომელიც პირდაპირ უკავშირდება PACT-ს, ბლოკავს PACT-PKR ურთიერთქმედებას, აფერხებს PKR აქტივაციას და eIF2α ფოსფორილირებას, რითაც აფერხებს სტრესით გამოწვეულ აპოპტოზს და კიბოს საბოლოო პროლიფერაციის სტიმულირება.უჯრედები.ეს აღმოჩენა ნათელს ჰფენს კიბოს პროგნოზისა და თერაპიის პოტენციურ lncRNA მიზნებს.
ჩვენმა მონაცემებმა აჩვენა, რომ DARS-AS1 ნოკდაუნი ახდენს უჯრედების სენსიბილიზაციას შრატის შიმშილის მიმართ ფოსფორილირებული PKR და eIF2α მნიშვნელოვანი ზრდით.ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ DARS-AS1 ხელს უწყობს კიბოს უჯრედების გადარჩენას მძიმე პირობებში PACT/PKR აქტივობის ინჰიბირებით.რამდენიმე სხვა არაკოდირებადი რნმ, როგორიცაა ASPACT და nc886, ასევე ჩართულია PACT/PKR ღერძში PACT48 mRNA-ს დაქვეითებით ან აუტოფოსფორილირების რეგულირებით PKR49,50,64-თან შეკავშირებით.მათ შორის, DARS-AS1 მოქმედებს როგორც PACT-PKR ასოციაციის დამრღვევი.ეს კვლევა ამდიდრებს ჩვენს გაგებას PACT/PKR ღერძის რეგულირებისა და lncRNA-ების როლზე სტრესის პასუხებში.
PACT შეიცავს სამ ცალკეულ დომენს.პირველი ორი dsRBD-დან თითოეული საკმარისია PACT-ის PKR-თან მაღალი აფინურობით შეკავშირების მისაღწევად, ხოლო მესამე დომენი (D3) საჭიროა PKR-ის გააქტიურებისთვის in vitro და in vivo.ჩვენმა კვლევამ აჩვენა, რომ DARS-AS1 უპირატესად ურთიერთქმედებს D3 დომენთან (ნახ. 3h).lncRNA-ს (768 ნუკლეოტიდი) დიდი ზომის გათვალისწინებით, DARS-AS1-ს D3-თან დაკავშირება შეუძლია ფიზიკურად დათრგუნოს dsRBD-სა და PKR-ის PACT დომენს შორის ურთიერთქმედება, რითაც დაბლოკოს PACT-ისა და PKR-ის კავშირი.PACT წერტილის მუტაციებმა, რომლებმაც შეცვალეს Ser246 და Ser287 D3-ში ალანინით ან ასპარტატით, დაარღვიეს მისი შეკავშირება DARS-AS1-თან, რაც მიუთითებს D3-ის საერთო სტრუქტურული და ელექტრული თვისებების მნიშვნელობაზე მათ ასოციაციაში.ამ მექანიზმის შემდგომი დეტალები საჭირო იქნება მომავალში უფრო ზუსტი ბიოქიმიური ანალიზისა და მაღალი გარჩევადობის PACT სტრუქტურული ანალიზის გამოყენებით.
წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ DARS-AS1 ხელს უწყობს უჯრედების პროლიფერაციას რამდენიმე მექანიზმის მეშვეობით51,52,53.ერთ მაგალითში, მკვლევარებმა დააფიქსირეს, რომ DARS-AS1 არეგულირებდა მის ანტისენსიურ პროტეინს DARS გენს, მიზნად ისახავდა miP-194-5p თირკმლის კიბოს უჯრედებში.თუმცა, წინამდებარე კვლევაში DARS-AS1 ნოკდაუნმა მცირე გავლენა მოახდინა DARS-ის ტრანსკრიფციაზე კიბოს მრავალი ტიპის, მათ შორის, სულ მცირე, კოლორექტალური, მკერდის და ღვიძლის კიბოში.იმის გამო, რომ lncRNA ავლენს უჯრედისა და ქსოვილის სპეციფიკურ ექსპრესიულ ნიმუშებს, ფუნქციური მექანიზმები შეიძლება არ იყოს კონსერვირებული კიბოს ტიპებში, რამაც შეიძლება ხელი შეუწყოს ამ შეუსაბამობას ჩვენს დაკვირვებებსა და სხვადასხვა კიბოს წინა შეფასებებს შორის.საჭიროა სპეციალური კვლევები სხვადასხვა ფიზიოლოგიური და პათოლოგიური პროცესების სპეციფიკური მექანიზმების გასარკვევად.
კლინიკური მონაცემების ანალიზმა აჩვენა, რომ DARS-AS1 გამოხატულება სიმსივნეებში უკუკავშირშია კიბოს პაციენტების გადარჩენასთან, რაც ხაზს უსვამს DARS-AS1/PACT/PKR ღერძის მნიშვნელობას კიბოს პროგნოზში.დასკვნის სახით, ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ DARS-AS1 არის PACT/PKR სასიგნალო ღერძის რეგულატორი, ხელს უწყობს კიბოს უჯრედების პროლიფერაციას და აფერხებს აპოპტოზს სტრესზე რეაგირების დროს, რაც უზრუნველყოფს კვლევის სხვა ხაზს და საინტერესოა მომავალი კვლევისთვის პოტენციური მკურნალობისთვის. .
ადამიანის უჯრედული ხაზები SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 და HEK293T მიღებული იქნა ჩინეთის ეროვნული უჯრედული ხაზის რესურსების ინფრასტრუქტურიდან.ყველა უჯრედი შენარჩუნებული იყო DMEM გარემოში (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) დამატებული 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) და 1% პენიცილინ-სტრეპტომიცინი (Thermo Fisher Scientific) 37°C-ზე, 5% CO2.ინკუბატორი.
ანტი-PACT, Abcam (ab31967);ანტი-PKR, Abcam (ab184257);ანტი-PKR (ფოსფო-T451), Abcam (ab81303);ანტი-დროშა, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));ანტი-eIF2α (ფოსფორი S51), Abcam (ab32157);ანტი-PACT (ფოსფორი S246), Abgent (AP7744b);ანტი-β-ტუბულინი, CST (2128);ნორმალური თაგვის IgG, CST (5415S);ნორმალური კურდღლის IgG, CST (2729S).ანტისხეულები განზავებული იყო 1:1000 PBST-ში Western blotting-ისთვის და 1:100 IP-სთვის.
sgRNA შეიქმნა საჯაროდ ხელმისაწვდომი ხელსაწყოს გამოყენებით, სახელწოდებით CRISPR-ERA66.ჩვენ გამოვიყენეთ ნაგულისხმევი ხელსაწყოს პარამეტრები sgRNA განვითარებისთვის და ალგორითმის გამოთვლილი sgRNA დამაკავშირებელი ადგილები 3 კბ რეგიონში.TSS-ზე ორიენტირებული.sgRNA ოლიგონუკლეოტიდების აუზები სინთეზირებული იყო CustomArray, Inc.-ში (Bothewell, WA) და კლონირებული იყო ჰუმანიზირებულ pgRNA პლაზმიდებში (Addgene #44248).სულ 12 მკგ გაერთიანებული ჰუმანიზებული pgRNA პლაზმიდი, 7.2 მკგ psPAX2 (Addgene #12260) და 4.8 მკგ pMD2.G (Addgene #12259) თანატრანსფექციით იქნა გადაყვანილი 5 x 106 HEK293T-ში დნმ-ის რეაქციის გამოყენებით დნმ-ის გადანაწილებით. უჯრედები (CWBIO, პეკინი, ჩინეთი) მწარმოებლის მითითებების შესაბამისად.ვირუსის შემცველი სუპერნატანტები შეგროვდა ტრანსფექციის შემდეგ 48 და 72 საათის შემდეგ და გაფილტრული იქნა 0,45 მკმ ფილტრის მეშვეობით.სკრინინგისთვის, SW620 უჯრედები, რომლებიც გამოხატავენ dCas9/KRAB შერწყმა პროტეინს, მიღებული იქნა ვირუსის ტრანსდუქციით.მოდიფიცირებული SW620 უჯრედები დაინფიცირდა ვირუსის ბიბლიოთეკით ოთხ დამოუკიდებელ ინფექციურ ექსპერიმენტში MOI 0.1-0.3-ზე და აღებული იქნა ნიმუში 2 მკგ/მლ პურომიცინით (Sigma, St. Louis, MO) 2 დღის განმავლობაში.ამის შემდეგ, უჯრედები კულტივირებული იყო 18 დღის განმავლობაში in vitro, მინიმალური ბიბლიოთეკის დაფარვით 500 უჯრედი/sgRNA სკრინინგისთვის.
გენომის დნმ ამოღებულია QIAamp DNA Blood Midi ნაკრების ინსტრუქციის მიხედვით (QIAGEN, დიუსელდორფი, გერმანია; 51183).საერთო ჯამში, ბიბლიოთეკის ასაგებად გამოყენებული იქნა 100 მკგ გენომიური დნმ ბიოლოგიურ გამეორებაზე.sgRNA რეგიონი გაძლიერდა PCR-ის ორი რაუნდით და დაუკავშირდა შტრიხ-კოდს.
PCR პროდუქტები გაიწმინდა NucleoSpin® გელისა და PCR გამწმენდი ნაკრების გამოყენებით (MACHEREY-NAGEL, Düren, გერმანია; 740609.250) და რაოდენობრივად შეფასდა Qubit™ HS ორჯაჭვიანი დნმ-ის გამოვლენის ნაკრების გამოყენებით (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS ანალიზი გამოიყენებოდა უჯრედების პროლიფერაციის გასაზომად.უჯრედები დათესეს 96 ჭაბურღილიან ფირფიტებში 2000 უჯრედი/ჭის საწყისი სიმკვრივით.უჯრედების ფარდობითი რაოდენობა იზომებოდა ყოველდღიურად მითითებულ დროს სულ 4-6 დღის განმავლობაში.თითოეული ჭაბურღილისთვის, 20 μl MTS რეაგენტი (პრომეგა) განზავებული იყო 100 μl DMEM-ით, ინკუბირებული იყო უჯრედებთან 4 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე და შემდეგ გაზომეს OD490.
დაუმაგრებელი ზრდის უნარი აღმოაჩინეს სფეროების ფორმირების ანალიზით.მოკლედ, 2000 უჯრედი, გადაყვანილი shRNA DARS-AS1-ით ან საკონტროლო shRNA-ით კულტივირებული იყო ულტრა დაბალ მიმაგრებულ მიკროპლატებში (Corning) საშუალო ცვლილებით ყოველ 4 დღეში.სფეროიდები დაითვალეს 14 დღის შემდეგ.DARS-AS1 ზედმეტად გამოხატვის პლაზმიდით ან საკონტროლო პლაზმიდით გადაყვანილი 500 უჯრედი გამოიყენებოდა გამაძლიერებელი ანალიზისთვის, წინააღმდეგ შემთხვევაში მეთოდი უცვლელი იყო.
რნმ ტრანსკრიბირებული იქნა T7 RNA პოლიმერაზასა და ბიოტინ-16-UTP (Roche 1138908910) გამოყენებით Riboprobe® Combination Systems-ის (Promega P1440) ინსტრუქციის მიხედვით.აქ გამოყენებული პრაიმერები ჩამოთვლილია დამატებით ცხრილში 4.
პროტეინის კოდირების PACT ან PKR რეგიონები კლონირებულ იქნა pET15b-ში (Addgene #73619) და გარდაიქმნება BL21 (DE3).ბაქტერიები ღამით ინკუბირებული იყო LB-ში, რომელსაც მიეწოდება ამპიცილინი და შემდეგ განზავდნენ 100-ჯერ ახალი LB-ით.როდესაც საშუალო OD600 მიაღწია 0.8-ს, 1 მმ IPTG დაემატა ცილის ექსპრესიის ინდუცირებისთვის.ღამით ინკუბაციის შემდეგ ნაზი შერყევით (250 rpm 20°C-ზე), უჯრედის მარცვლები შეგროვდა ცენტრიფუგაციით (4000 rpm, 10 min, 4°C).უჯრედის მარცვლები ხელახლა შეაჩერეთ ლიზის ბუფერში (50 მმ ტრისი, pH 8.0, 250 მმ NaCl, 1 მმ PMSF) და გააჩერეთ ყინულზე 30 წუთის განმავლობაში, შემდეგ ჩაატარეთ სონიკატი (15 წთ, ჩართვა/გამორთვა, ყინულზე) და ცენტრიფუგა (13,000). rpm)., 30 წთ, 4°С).შემდეგ სუპერნატანი ჩატვირთეს Ni-NTA ფისზე (QIAGEN) 3-ჯერ 4°C-ზე, 4-ჯერ გარეცხეს სარეცხი ბუფერით (50 მმ Tris, pH 8.0, 40 მმ იმიდაზოლი, 250 მმ NaCl) და გამოირეცხეს 3-ჯერ, საერთო ჯამში. 10 მლ ელუენტ ბუფერიდან (50 მმ ტრისი, pH 8.0, 250 მმ NaCl, 300 მმ იმიდაზოლი).გაწმენდილი ცილა განისაზღვრა WB-ის გამოყენებით და კონცენტრაცია განისაზღვრა Qubit™ ცილის საანალიზო ნაკრების გამოყენებით (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP ანალიზები შესრულდა ისე, როგორც ადრე იყო აღწერილი, ცვლილებებით.მოკლედ, 1x RIP ბუფერი (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin რიბონუკლეაზას ინჰიბიტორი (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, პროტეაზა) სტატიკური 71 xcyto. (Roche, 1 მმ DTT) და ცენტრიფუგა 13000 rpm-ზე 15 წუთის განმავლობაში 4 °C-ზე.შემდეგ სუპერნატანი ინკუბირებული იყო პროტეინის A+G მაგნიტური მარცვლებით (Milipore) კონიუგირებული 5 მკგ ანტი-PACT ანტისხეულთან (Abeam) ან IgG (CST).მარცვლები გარეცხეს 5-ჯერ 5x RIP ბუფერით, შემდეგ დაიჯესტინეს პროტეინაზა K (NEB).რნმ ამოღებულია ტრიზოლით და განისაზღვრა RT-qPCR-ით.პრაიმერები წარმოდგენილია დამატებით ცხრილში 5.
ინ ვიტრო RIP ანალიზი ჩატარდა შეცვლილი სტანდარტული RIP ანალიზის პროტოკოლის მიხედვით.სულ 5 pmol in vitro ტრანსკრიბირებული რნმ განზავებული იყო 1x RIP ბუფერით და ადუღდა ინკუბაციით 65°C-ზე 5 წუთის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა ნელი გაციება ოთახის ტემპერატურამდე.სულ 5 pmol უცვლელი ან მუტაციური დროშის ეტიკეტირებული PACT ცილა გაიწმინდა E. coli-სგან.ინკუბაცია რენატურირებული რნმ-ით 2 საათის განმავლობაში 4°C-ზე და მიჰყევით ზემოხსენებულ პროცედურას RIP ანალიზისთვის დროშის საწინააღმდეგო IP-სთვის.
რნმ-ის გაფართოების ანალიზისთვის, 1×107 უჯრედი ლიზირებული იყო 1xRIP ბუფერით.ცენტრიფუგაციის შემდეგ 13000 rpm-ზე 15 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე, სუპერნატანტი წინასწარ დამუშავდა 30 μl სტრეპტავიდინის მაგნიტური მარცვლებით (Beckman) 2 საათის განმავლობაში 4°C-ზე.შემდეგ გასუფთავებულ ლიზატს მიეწოდება საფუარის tRNA და ინკუბირებული იყო 40 pmol რენატურირებული რნმ-ით ღამით 4°C-ზე, შემდეგ კიდევ 2 საათის განმავლობაში და დაემატა 20 μl ახალი სტრეპტავიდინის მაგნიტური მარცვლები დაბლოკილი BSA-ით.სარეცხი ეტაპი შედგებოდა 4 ჯერ 5x RIP ბუფერით და 4 ჯერ 1x RIP ბუფერით.შესაბამისი ცილები გაირეცხა ბიოტინის გამორეცხვის ბუფერით (25 მმ ტრის-HCl, pH 7.5, 12.5 მმ D-ბიოტინი, PMSF) და გამოეყო NuPAGE 4-12% ბის-ტრის გელზე (ინვიტროგენი).ვერცხლის შეღებვის შემდეგ (Beyotime Biotechnology), გარკვეული ზოლები ამოკვეთეს და გაანალიზეს MS-ით.
Co-IP ანალიზი ჩატარდა PACT-სა და PKR-ს შორის ურთიერთქმედების შესამოწმებლად.მოკლედ, სუპერნატანტის ლიზატები მომზადდა 1 x 107 ლიზირებული უჯრედის ინკუბაციით 1 x RIP ბუფერში, რასაც მოჰყვა ცენტრიფუგაცია 13000 rpm-ზე 15 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე.ლიზატები დატვირთული იყო პროტეინის A + G მაგნიტური მარცვლებით, კონიუგირებული იყო 5 მკგ ანტი-PACT ანტისხეულთან და ნაზად ბრუნავდა ღამით 4°C-ზე.მარცვლები გარეცხილი იყო 3-ჯერ 5×RIP ბუფერით, ორჯერ 1×RIP ბუფერით და გაირეცხა 1×SDS ბუფერით.ამოღებული ცილა გაანალიზდა SDS-PAGE გელით და გამოვლინდა WB-ით.
ორი pmol დროშის მქონე PACT და 1 pmol PKR გაწმენდილი იყო E. coli-სგან.განზავდეს 1× RIP ბუფერში და ინკუბირება 10 pmol რენატურირებული რნმ-ით 2 საათის განმავლობაში 4 °C-ზე.ამის შემდეგ, ისინი ინკუბირებული იქნა პროტეინით A+G მაგნიტური მარცვლებით კონიუგირებული ანტი-ეტიკეტირებული ანტისხეულით დამატებით ორი საათის განმავლობაში.შემდეგ მძივები გარეცხეს ოთხჯერ 1x RIP ბუფერით და გამოირეცხეს 1x SDS ბუფერით.შედეგად მიღებული PACT და PKR გამოვლინდა მსოფლიო ბანკის მიერ.