სიახლეები

გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს.ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვიყვანთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
ფერმენტული სიახლოვის მარკირების მეთოდები, რომლებიც დაფუძნებულია გააქტიურებულ ეთერებზე ან ფენოქსი რადიკალებზე, ფართოდ გამოიყენება ცოცხალ უჯრედებში სუბუჯრედული პროტეომებისა და ცილების ინტერაქტორების გამოსასახად.თუმცა, გააქტიურებული ეთერები ნაკლებად რეაქტიულები არიან, რაც იწვევს ეტიკეტირების ფართო რადიუსს და პეროქსიდით გამომუშავებულ ფენოქსი რადიკალებს შეუძლიათ ხელი შეუშალონ რედოქს გზებს.აქ ჩვენ ვახსენებთ სიახლოვის მარკირებაზე დამოკიდებული ფოტოაქტივაციის (PDPL) მეთოდს, რომელიც შემუშავებულია miniSOG ფოტომგრძნობიარე პროტეინის გენეტიკური დაკავშირებით ინტერესის პროტეინთან.ცისფერი შუქით გამოწვეული და ექსპოზიციის დროით კონტროლირებადი, ჟანგბადი წარმოიქმნება და შემდეგ მიიღწევა ჰისტიდინის ნარჩენების სივრცითი-დროით განსაზღვრული მარკირება ანილინის ზონდით.ჩვენ ვაჩვენებთ მის მაღალ ერთგულებას ორგანელების სპეციფიკური პროტეომის რუკის საშუალებით.PDPL-ის გვერდიგვერდ შედარება TurboID-თან გვიჩვენებს PDPL-ის უფრო სპეციფიკურ და ყოვლისმომცველ პროტეომიურ გაშუქებას.შემდეგ, ჩვენ გამოვიყენეთ PDPL დაავადებასთან ასოცირებულ ტრანსკრიპციულ კოაქტივატორ BRD4-სა და E3 პარკინის ლიგაზაზე და ვიპოვეთ ადრე უცნობი ინტერაქტორები.ზედმეტად გამოხატული სკრინინგით, პარკინისთვის იდენტიფიცირებული იყო ორი უცნობი სუბსტრატი, Ssu72 და SNW1, რომელთა დეგრადაცია შუამავლობით ხდება უბიკვიტინაცია-პროტეაზომის გზაზე.
ცილის ქსელების ზუსტი დახასიათება საფუძვლად უდევს ბევრ ფუნდამენტურ ფიჭურ პროცესს.აქედან გამომდინარე, ცილების ურთიერთქმედების უაღრესად ზუსტი სივრცითი-დროებითი რუქა უზრუნველყოფს მოლეკულურ საფუძველს ბიოლოგიური გზების, დაავადების პათოლოგიის გაშიფვრისთვის და ამ ურთიერთქმედების თერაპიული მიზნებისთვის ჩაშლისთვის.ამ მიზნით, ძალზე სასურველია მეთოდები, რომლებსაც შეუძლიათ ცოცხალ უჯრედებში ან ქსოვილებში დროებითი ურთიერთქმედების გამოვლენა.აფინურობის გამწმენდი მასის სპექტრომეტრია (AP-MS) ისტორიულად გამოიყენებოდა ინტერესის ცილების (POIs) დამაკავშირებელი პარტნიორების იდენტიფიცირებისთვის.რაოდენობრივი პროტეომიკის მეთოდების შემუშავებით შეიქმნა Bioplex3.0, AP-MS-ზე დაფუძნებული ცილოვანი ქსელების უდიდესი მონაცემთა ბაზა.მიუხედავად იმისა, რომ AP-MS ძალიან ძლიერია, უჯრედების ლიზისა და განზავების საფეხურები სამუშაო ნაკადში მიკერძოებულია სუსტი და გარდამავალი შემაკავშირებელ ურთიერთქმედებისკენ და შემოაქვს ლიზის შემდგომ არტეფაქტებს, როგორიცაა ყალბი ურთიერთქმედების წყვილები, რომლებსაც არ აქვთ ნაწილებად დაყოფა ლიზისამდე.
ამ საკითხების გადასაჭრელად, შემუშავებულია არაბუნებრივი ამინომჟავები (UAA) ჯვარედინი ჯგუფებით და ფერმენტული ეტიკეტირების (PL) პლატფორმებით (მაგ. APEX და BioID)5.მიუხედავად იმისა, რომ UAA მეთოდი წარმატებით იქნა გამოყენებული ბევრ სცენარში და გვაწვდის ინფორმაციას პირდაპირი ცილის ადჰეზივების შესახებ, მაინც საჭიროა UAA ჩასმის ადგილის ოპტიმიზაცია.რაც მთავარია, ეს არის სტექიომეტრიული მარკირების მეთოდი, რომელსაც არ გააჩნია მარკირების მოვლენების კატალიზური შებრუნება.ამის საპირისპიროდ, ფერმენტული PL მეთოდები, როგორიცაა BioID მეთოდი, აერთიანებს ინჟინერირებულ ბიოტინ ლიგაზას POI7-თან, რომელიც შემდგომში ააქტიურებს ბიოტინს რეაქტიული ბიოტინილ-AMP ეთერის შუალედის წარმოქმნით.ამგვარად, ფერმენტი კატალიზებს და ათავისუფლებს გააქტიურებულ ბიოტინს „ღრუბელს“, რომელიც ასახელებს პროქსიმალურ ლიზინის ნარჩენებს.თუმცა, BioID-ს სჭირდება 12 საათზე მეტი საკმარისი ეტიკეტირებული სიგნალის მისაღებად, რაც გამორიცხავს მის გამოყენებას დროებითი გარჩევადობით.საფუარის ჩვენებაზე დაფუძნებული მიმართული ევოლუციის გამოყენებით, TurboID შეიქმნა BioID-ის საფუძველზე, რათა უფრო ეფექტური იყოს, რაც საშუალებას იძლევა ეფექტური მარკირება ბიოტინით 10 წუთში, რაც უფრო დინამიური პროცესების შესწავლის საშუალებას იძლევა.იმის გამო, რომ TurboID ძალიან აქტიურია და ენდოგენური ბიოტინის დონე საკმარისია დაბალი დონის მარკირებისთვის, ფონური მარკირება პოტენციურ პრობლემად იქცევა, როდესაც საჭიროა ძლიერ გაძლიერებული და დროული მარკირება ეგზოგენური ბიოტინის დამატებით.გარდა ამისა, გააქტიურებული ეთერები ცუდად რეაქტიულები არიან (t1/2 ~ 5 წთ), რამაც შეიძლება გამოიწვიოს დიდი მარკირების რადიუსი, განსაკუთრებით მეზობელი ცილების ბიოტინ 5-ით გაჯერების შემდეგ. ფენოლის რადიკალებს და საშუალებას აძლევს ცილების მარკირებას ერთ წუთში9,10. APEX ფართოდ გამოიყენება სუბუჯრედული პროტეომების, მემბრანის ცილის კომპლექსების და ციტოზოლური სასიგნალო ცილის კომპლექსების იდენტიფიცირებისთვის11,12. თუმცა, პეროქსიდების მაღალი კონცენტრაციის საჭიროებამ შეიძლება გავლენა მოახდინოს რედოქს ცილებს ან გზებზე, არღვევს ფიჭური პროცესები.
ამრიგად, ახალი მეთოდი, რომელსაც შეუძლია წარმოქმნას უფრო რეაქტიული ეტიკეტირებული რადიუსის ჩახშობის სახეობები მაღალი სივრცითი და დროითი სიზუსტით, უჯრედული გზების მნიშვნელოვანი დარღვევის გარეშე, მნიშვნელოვანი დამატება იქნება არსებულ მეთოდებში. რეაქტიულ სახეობებს შორის ჟანგბადმა მიიპყრო ჩვენი ყურადღება მისი ხანმოკლე სიცოცხლისა და შეზღუდული დიფუზიის რადიუსის გამო (t1/2 < 0,6 μs უჯრედებში)13. რეაქტიულ სახეობებს შორის ჟანგბადმა მიიპყრო ჩვენი ყურადღება მისი ხანმოკლე სიცოცხლისა და შეზღუდული დიფუზიის რადიუსის გამო (t1/2 < 0,6 μs უჯრედებში)13. Среди активна форма наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и შეზღუდული радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. აქტიურ ფორმებს შორის, ჟანგბადმა მიიპყრო ჩვენი ყურადღება მისი ხანმოკლე სიცოცხლისა და შეზღუდული დიფუზიის რადიუსის გამო (t1/2 < 0,6 μs უჯრედებში)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中有限（细胞中摵〵中摏瀚中摑1/2 < 0.6 而耺弉 1/2 < 0,6 μs）而引起了我们的注意13 Среди Активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и შეზღუდული радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). აქტიურ ფორმებს შორის ერთჯერადი ჟანგბადი იპყრობს ჩვენს ყურადღებას მისი ხანმოკლე სიცოცხლისა და შეზღუდული დიფუზიის რადიუსის გამო (t1/2 < 0,6 μs უჯრედებში).ცნობილია, რომ ერთჯერადი ჟანგბადი შემთხვევით აჟანგებს მეთიონინს, ტიროზინს, ჰისტიდინს და ტრიპტოფანს, რაც მას პოლარად აქცევს 14,15 ამინის ან თიოლზე დაფუძნებულ ზონდებთან მიმაგრებისთვის16,17.მიუხედავად იმისა, რომ ერთჯერადი ჟანგბადი გამოიყენებოდა უჯრედქვეშა განყოფილების რნმ-ის მარკირებისთვის, ენდოგენური POI სიახლოვის მარკერების ხელახალი დანიშნულების სტრატეგიები რჩება შეუსწავლელი.აქ წარმოგიდგენთ პლატფორმას, სახელწოდებით ფოტოაქტივაციაზე დამოკიდებული სიახლოვის მარკირება (PDPL), სადაც ვიყენებთ ლურჯ შუქს miniSOG ფოტომგრძნობიარესთან შერწყმული POI-ების გასანათებლად და ჟანგბადის ერთჯერადი წარმოქმნის გასააქტიურებლად პროქსიმალური ნარჩენების დაჟანგვის მიზნით, რასაც მოჰყვება ამინის შემცველი ცვლილებები ქიმიური ზონდების დასაჟანგად. შუალედური ცოცხალი უჯრედები..ჩვენ გამოვცადეთ ქიმიური ზონდების ჯგუფი, რათა გაზარდოთ ტეგის სპეციფიკა და დავადგინეთ მოდიფიკაციის ადგილები ღია პროტეომიკის სამუშაო ნაკადის გამოყენებით.PDPL-ის გვერდიგვერდ შედარება TurboID-თან გვიჩვენებს PDPL-ის უფრო სპეციფიკურ და ყოვლისმომცველ პროტეომიურ გაშუქებას.ჩვენ გამოვიყენეთ ეს მიდგომა სუბუჯრედული პროტეომის ორგანულ სპეციფიკურ მარკერებზე და კიბოსთან ასოცირებული ეპიგენეტიკური მარეგულირებელი პროტეინის BRD4-ისა და პარკინსონის დაავადებასთან დაკავშირებული E3 ლიგაზა პარკინის დამაკავშირებელი პარტნიორების ზოგადი პროტეომის იდენტიფიკაციისთვის, რამაც დაადასტურა ცილის როგორც ცნობილი, ასევე უცნობი ქსელი. ურთიერთქმედებები..PDPL-ის უნარი ამოიცნოს E3 სუბსტრატები დიდ ცილოვან კომპლექსებში წარმოადგენს სიტუაციას, სადაც საჭიროა არაპირდაპირი შემკვრელების ამოცნობა.ორი უცნობი პარკინის სუბსტრატი, შუამავალი უბიკვიტინაციით-პროტეაზომით, დადასტურებულია in situ.
ფოტოდინამიკური თერაპია (PDT)19 და ქრომოფორის დახმარებით ლაზერული ინაქტივაცია (CALI)20, რომლის დროსაც სინათლის დასხივება ფოტოსენსიბილიზატორებით წარმოქმნის ერთჯერადი ჟანგბადს, შეუძლია სამიზნე ცილების ინაქტივაცია ან უჯრედების სიკვდილი გამოიწვიოს.ვინაიდან ერთჯერადი ჟანგბადი არის უაღრესად რეაქტიული ნივთიერება, თეორიული დიფუზიის მანძილით დაახლოებით 70 ნმ, სივრცით შეზღუდული დაჟანგვა შესაძლებელია ფოტოსენსიბილიზატორის გარშემო.ამ კონცეფციიდან გამომდინარე, ჩვენ გადავწყვიტეთ გამოგვეყენებინა ერთიანი ჟანგბადი ცოცხალ უჯრედებში ცილის კომპლექსების მჭიდრო მარკირების მისაღწევად.ჩვენ შევიმუშავეთ PDPL ქიმიოპროტეომიული მიდგომა ოთხი ფუნქციის შესასრულებლად: (1) PL ფერმენტული მიდგომის მსგავსი აქტიური ერთჯერადი ჟანგბადის წარმოქმნის კატალიზება;(2) უზრუნველყოს დროში გადაწყვეტილი მარკირება სინათლის დაწყებისას;(3) შეცვლით (4) მოერიდეთ ენდოგენური კოფაქტორების (როგორიცაა ბიოტინი) გამოყენებას ფონის შესამცირებლად, ან გამოიყენოთ ძლიერ შემაშფოთებელი ეგზოგენური რეაგენტები (როგორიცაა პეროქსიდები), რათა მინიმუმამდე დაიყვანოთ უჯრედის ზემოქმედება გარემო სტრესზე.
ფოტოსენსიბილიზატორები შეიძლება დაიყოს ორ კატეგორიად, მათ შორის მცირე მოლეკულური წონის ფტორფორები (მაგ. ვარდი ბენგალი, მეთილენის ლურჯი)22 და გენეტიკურად დაშიფრული მცირე ცილები (მაგ. miniSOG, KillerRed)23.მოდულური დიზაინის მისაღწევად, ჩვენ შევიმუშავეთ პირველი თაობის PDPL პლატფორმა POI24,25-ში ფოტომგრძნობიარე (PS) ცილების დამატებით (სურათი 1a).ცისფერი შუქით დასხივებისას, ჟანგბადი იჟანგება პროქსიმალური ნუკლეოფილური ამინომჟავების ნარჩენებს, რის შედეგადაც წარმოიქმნება ერთიანი პოლარობა, რომელიც არის ელექტროფილური და შეუძლია შემდგომში რეაგირება მოახდინოს ამინის ზონდის ნუკლეოფილებთან16,17.ზონდი შექმნილია ალკინის სახელურით, რათა დაწკაპუნების ქიმია და ქვევით ჩამოწევა LC/MS/MS დახასიათებისთვის.
miniSOG-ის შუამავლობით ცილოვანი კომპლექსების მარკირების სქემატური ილუსტრაცია.ცისფერი შუქის ზემოქმედებისას, უჯრედები, რომლებიც გამოხატავენ miniSOG-POI, წარმოქმნიან ერთჯერადი ჟანგბადს, რომელიც ცვლის ურთიერთქმედების პროტეინებს, მაგრამ არა შემაკავშირებელ ცილებს.ფოტოჟანგვის შუალედური პროდუქტები იჭრება ამინის ქიმიური ზონდის სარელეო ეტიკეტებით კოვალენტური დანამატების წარმოქმნით.ალკინილის ჯგუფი ქიმიურ ზონდზე იძლევა დაწკაპუნების ქიმიის გამდიდრების საშუალებას ჩამოწევის გზით, რასაც მოჰყვება LC-MS/MS რაოდენობრივი რაოდენობა.b ამინის ზონდების ქიმიური სტრუქტურა 1-4.c რეპრეზენტატიული ფლუორესცენტური გელის ანალიზი მიტოქონდრიული ლოკალიზებული miniSOG-ს შუამავლობით პროტეომიული მარკერების გამოყენებით ზონდებიდან 1-4 და შედარებითი რაოდენობრივი განსაზღვრა გელის დენსიტომეტრიის საფუძველზე.ქიმიური ზონდების სიგნალისა და ფონის თანაფარდობა შეფასდა უარყოფითი საკონტროლო ექსპერიმენტების გამოყენებით ლურჯი სინათლის გამოკლებით ან HEK293T უჯრედების გამოყენებით miniSOG გამოხატვის გარეშე.n = 2 ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი ნიმუში.თითოეული წერტილი წარმოადგენს ბიოლოგიურ რეპლიკას.d PDPL-ის წარმომადგენლობითი გამოვლენა და რაოდენობრივი განსაზღვრა ოპტიმიზებული ზონდის 3-ის გამოყენებით მითითებული PDPL კომპონენტების თანდასწრებით ან არარსებობით, როგორიცაა c.n = 3 ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი ნიმუში.თითოეული წერტილი წარმოადგენს ბიოლოგიურ რეპლიკას.ცენტრალური ხაზები და ულვაშები წარმოადგენს საშუალო და ± სტანდარტულ გადახრას.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e ერთჯერადი ჟანგბადის კონფოკალური გამოსახულება შორს წითელი Si-DMA ლაქით.მასშტაბის ზოლი: 10 μm.გელის გამოსახულება და კონფოკალური ექსპერიმენტები დამოუკიდებლად განმეორდა მინიმუმ ორჯერ მსგავსი შედეგებით.
ჩვენ პირველად შევამოწმეთ მომწიფებული ფოტოსენსიბილიზატორების miniSOG26 და KillerRed23 უნარი, სტაბილურად გამოხატული HEK293T-ში, რათა შუამავლობდნენ პროტეომის პროპარგილამინის მარკირებას, როგორც ქიმიურ ზონდს (დამატებითი სურ. 1a).გელის ფლუორესცენციულმა ანალიზმა აჩვენა, რომ მთლიანი პროტეომის მარკირება მიღწეული იყო miniSOG და ლურჯი სინათლის დასხივების გამოყენებით, ხოლო KillerRed-ით ხილული მარკირების პროდუქტი არ დაფიქსირებულა.სიგნალი-ფონის თანაფარდობის გასაუმჯობესებლად, ჩვენ გამოვცადეთ ქიმიური ზონდების ნაკრები, რომელიც შეიცავს ანილინს (1 და 3), პროპილამინს (2) ან ბენზილამინს (4).ჩვენ დავაკვირდით, რომ თავად HEK293T უჯრედებს ჰქონდათ უფრო მაღალი ფონური სიგნალი ლურჯ შუქთან შედარებით, შესაძლოა, ენდოგენური რიბოფლავინის ფოტომგრძნობიარე ფლავინის მონონუკლეოტიდის (FMN) 27 გამო. ანილინზე დაფუძნებულმა ქიმიურმა ზონდებმა 1 და 3 მისცეს უკეთესი სპეციფიკა, HEK293T სტაბილურად გამოხატავს miniSOG-ს მიტოქონდრიებში, აჩვენებს სიგნალის >8-ჯერ ზრდას ზონდისთვის 3, ხოლო ზონდი 2, რომელიც გამოიყენება რნმ-ის მარკირების მეთოდში, CAP-seq მხოლოდ ~2.5-ს აჩვენებს. სიგნალის გამრავლება, სავარაუდოდ, რნმ-სა და პროტეინს შორის რეაქტიულობის განსხვავებული პრეფერენციების გამო (ნახ. 1b, c). ანილინზე დაფუძნებულმა ქიმიურმა ზონდებმა 1 და 3 მისცეს უკეთესი სპეციფიკა, HEK293T სტაბილურად გამოხატავს miniSOG-ს მიტოქონდრიებში, აჩვენებს სიგნალის >8-ჯერ ზრდას ზონდისთვის 3, ხოლო ზონდი 2, რომელიც გამოიყენება რნმ-ის მარკირების მეთოდში, CAP-seq მხოლოდ ~2.5-ს აჩვენებს. სიგნალის გამრავლება, სავარაუდოდ, რნმ-სა და პროტეინს შორის რეაქტიულობის განსხვავებული პრეფერენციების გამო (ნახ. 1b, c).ანილინზე დაფუძნებულმა ქიმიურმა ზონდებმა 1 და 3 აჩვენეს უკეთესი სპეციფიკა: HEK293T, რომელიც სტაბილურად გამოხატავს miniSOG-ს მიტოქონდრიებში, აჩვენებს სიგნალის 8-ჯერ მეტ ზრდას ზონდისთვის 3, ხოლო ზონდი 2, რომელიც გამოიყენება მხოლოდ CAP-seq RNA ეტიკეტირების მეთოდში. აჩვენებს სიგნალის ~2.5-ჯერ ზრდას, სავარაუდოდ რნმ-სა და პროტეინს შორის რეაქტიულობის განსხვავებული პრეფერენციების გამო (ნახ. 1b, c).. 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。. -倍信号增加，可能是由于RNAანილინზე დაფუძნებულ ქიმიურ ზონდებს 1 და 3 ჰქონდათ უკეთესი სპეციფიკა, HEK293T სტაბილურად გამოხატავდა miniSOG მიტოქონდრიებში და ზონდს 3 ჰქონდა სიგნალის 8-ჯერ ზრდა, ხოლო ზონდს 2 CAP-seq RNA მარკირების მეთოდისთვის აჩვენა მხოლოდ ~2.5-ჯერ ზრდა.სიგნალში, სავარაუდოდ რნმ-სა და პროტეინს შორის რეაქციის განსხვავებული უპირატესობის გამო (ნახ. 1b, c).გარდა ამისა, გამოკვლევის 3 იზომერები და ჰიდრაზინის ზონდები (ზონდები 5, 6, 7) იქნა ტესტირება, რაც ადასტურებს ზონდის 3-ის ოპტიმიზაციას (დამატებითი ნახ. 1b,c).ანალოგიურად, გელის ფლუორესცენციის ანალიზმა გამოავლინა სხვა ოპტიმიზებული ექსპერიმენტული პარამეტრები: დასხივების ტალღის სიგრძე (460 ნმ), ქიმიური ზონდის კონცენტრაცია (1 მმ) და დასხივების დრო (20 წთ) (დამატებითი ნახ. 2a–c).PDPL პროტოკოლში რომელიმე კომპონენტის ან ნაბიჯის გამოტოვებამ გამოიწვია სიგნალის მნიშვნელოვანი გადაბრუნება ფონზე (ნახ. 1d).აღსანიშნავია, რომ ცილის მარკირება მნიშვნელოვნად შემცირდა ნატრიუმის აზიდის ან ტროლოქსის თანდასწრებით, რომლებიც, როგორც ცნობილია, აქრობს ჟანგბადს.D2O-ს არსებობა, რომელიც ცნობილია ჟანგბადის ერთჯერადი სტაბილიზაციისთვის, აძლიერებს მარკირების სიგნალს.ეტიკეტირებაში სხვა რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების წვლილის გამოსაკვლევად, მანიტოლი და ვიტამინი C დაემატა ჰიდროქსილის და სუპეროქსიდის რადიკალების გამწმენდის დასამყარებლად, შესაბამისად, 18, 29, მაგრამ ისინი ვერ ამცირებდნენ მარკირებას.H2O2-ის დამატებამ, მაგრამ არა განათებამ, არ გამოიწვია მარკირება (დამატებითი სურ. 3a).ფლუორესცენციული ჟანგბადის გამოსახულება Si-DMA ზონდებით დაადასტურა ერთჯერადი ჟანგბადის არსებობა HEK293T-miniSOG სადენში, მაგრამ არა თავდაპირველ HEK293T სადენში.გარდა ამისა, mitoSOX Red-მა ვერ აღმოაჩინა სუპეროქსიდის წარმოქმნა განათების შემდეგ (ნახ. 1e და დამატებითი ნახ. 3b) 30. ეს მონაცემები მტკიცედ მეტყველებს იმაზე, რომ ცალმხრივი ჟანგბადი არის მთავარი რეაქტიული ჟანგბადის სახეობა, რომელიც პასუხისმგებელია შემდგომ პროტეომულ მარკირებაზე.PDPL-ის ციტოტოქსიკურობა შეფასებული იყო ლურჯი სინათლის დასხივების და ქიმიური ზონდების ჩათვლით, და მნიშვნელოვანი ციტოტოქსიურობა არ დაფიქსირებულა (დამატებითი სურ. 4a).
მარკირების მექანიზმის შესასწავლად და LC-MS/MS-ის გამოყენებით ცილოვანი კომპლექსების პროტეომიული იდენტიფიკაციის გასააქტიურებლად, ჩვენ ჯერ უნდა განვსაზღვროთ რომელი ამინომჟავებია მოდიფიცირებული და გამოკვლევების დელტა მასა.მეთიონინი, ჰისტიდინი, ტრიპტოფანი და ტიროზინი მოდიფიცირებულია ერთჯერადი ჟანგბადით14,15.ჩვენ ვაერთიანებთ TOP-ABPP31 სამუშაო პროცესს მიუკერძოებელ ღია ძიებასთან, რომელიც მოწოდებულია FragPipe კომპიუტერული პლატფორმის მიერ, რომელიც დაფუძნებულია MSFragger32-ზე.ჟანგბადის ერთჯერადი მოდიფიკაციისა და ქიმიური ზონდის მარკირების შემდეგ, დაწკაპუნების ქიმია განხორციელდა ბიოტინის შემცირების ეტიკეტის გამოყენებით, რომელიც შეიცავს გაყოფად მაკავშირებელს, რასაც მოჰყვა ნეიტრავიდინის გაჭიმვა და ტრიპსინის მონელება.მოდიფიცირებული პეპტიდი, რომელიც ჯერ კიდევ შეკრული იყო ფისთან, იყო ფოტოკლევაცია LC-MS/MS ანალიზისთვის (სურათი 2a და დამატებითი მონაცემები 1).მოდიფიკაციების დიდი რაოდენობა მოხდა პროტეომში 50-ზე მეტი პეპტიდური რუქის (PSM) შესატყვისი ჩამოთვლილი (ნახ. 2b).გასაკვირია, რომ ჩვენ მხოლოდ ჰისტიდინის მოდიფიკაცია დავაფიქსირეთ, სავარაუდოდ, ოქსიდირებული ჰისტიდინის უფრო მაღალი რეაქტიულობის გამო ანილინის ზონდების მიმართ, ვიდრე სხვა ამინომჟავები.ერთჯერადი ჟანგბადით ჰისტიდინის დაჟანგვის გამოქვეყნებული მექანიზმის მიხედვით,21,33 შემოთავაზებული დელტა-მასური სტრუქტურა +229 Da შეესაბამება ზონდის 3-ის შეერთებას 2-ოქსო-ჰისტიდინთან ორი დაჟანგვის შემდეგ, ხოლო +247 Da არის ჰიდროლიზის პროდუქტი. of +229 Da (დამატებითი სურ. 5).MS2 სპექტრის შეფასებამ აჩვენა y და b იონების უმრავლესობის იდენტიფიკაციის მაღალი საიმედოობა, მოდიფიცირებული ფრაგმენტის იონების (y და b) იდენტიფიკაციის ჩათვლით (ნახ. 2c).PDPL-მოდიფიცირებული ჰისტიდინების ადგილობრივი თანმიმდევრობის კონტექსტის ანალიზმა გამოავლინა ზომიერი მოტივის უპირატესობა მცირე ჰიდროფობიური ნარჩენებისთვის ±1 პოზიციებზე (დამატებითი სურ. 4b).საშუალოდ, 1.4 ჰისტიდინი იდენტიფიცირებული იყო თითო ცილაზე და ამ მარკერების ადგილები განისაზღვრა გამხსნელზე ხელმისაწვდომ ზედაპირის ფართობის (SASA) და გამხსნელის შედარებითი ხელმისაწვდომობის (RSA) ანალიზით (დამატებითი სურ. 4c,d).
მიუკერძოებელი სამუშაო პროცესი ნარჩენი სელექციურობის შესასწავლად FragPipe გამოთვლითი პლატფორმის გამოყენებით MSFragger-ის მიერ.დაშლილი ლინკერები გამოიყენება Click ქიმიაში, რათა მოხდეს სტრეპტავიდინის ფისიდან მოდიფიცირებული პეპტიდების ფოტოგატეხვა.დაიწყო ღია ძებნა მრავალი მოდიფიკაციის, ასევე შესაბამისი ნარჩენების გამოსავლენად.b მიანიჭეთ ცვლილებების მასა, რომელიც ხდება მთელ პროტეომში.პეპტიდური რუკების PSM.c MS2 სპექტრული ანოტაცია ჰისტიდინის უბნების მოდიფიცირებული ზონდით 3. როგორც წარმომადგენლობითი მაგალითი, კოვალენტური რეაქცია ზონდთან 3 დაამატა +229,0938 Da მოდიფიცირებულ ამინომჟავას.d მუტაციის ანალიზი გამოიყენება PDPL მარკერების შესამოწმებლად.PRDX3 (H155A, H225A) და PRDX1 (H10A, H81A, H169A) გადაიცვეს ველური ტიპის პლაზმიდებით დროშის საწინააღმდეგო გამოვლენისთვის.e სინთეზური პეპტიდი რეაგირებდა გასუფთავებულ miniSOG-ით ზონდის 3-ის თანდასწრებით და შესაბამისი პროდუქტები Δm +247 და +229 აღინიშნა LC-MS სპექტრში.f in vitro ცილა-პროტეინის ურთიერთქმედება მოდელირებული miniSOG-6xHis-tag და anti-6xHis ანტისხეულებით.ანტიბიოტინი (სტრეპტავიდინი-HRP) და თაგვის საწინააღმდეგო Western blot ანალიზი miniSOG-6xHis/anti-6xHis ანტისხეულების კომპლექსების ეტიკეტირებული ზონდით 3, დამოკიდებულია სინათლის ზემოქმედების დროზე.ცალკეული ცილების ეტიკეტები გამოხატულია შესაბამის მოლეკულურ წონაში: LC ანტისხეულების მსუბუქი ჯაჭვი, HC ანტისხეულების მძიმე ჯაჭვი.ეს ექსპერიმენტები დამოუკიდებლად განმეორდა სულ მცირე ორჯერ მსგავსი შედეგებით.
მარკირების ადგილის ბიოქიმიური შემოწმებისთვის, მასსპექტრომეტრიით იდენტიფიცირებული PRDX3 და PRDX1 შეიცვალა ჰისტიდინიდან ალანინად და შეადარეს ველურ ტიპს ტრანსფექციის ანალიზებში.PDPL-ის შედეგებმა აჩვენა, რომ მუტაციამ მნიშვნელოვნად შეამცირა მარკირება (ნახ. 2d).იმავდროულად, ღია ძიების დროს გამოვლენილი პეპტიდური თანმიმდევრობები სინთეზირებული იყო და რეაგირებდა in vitro გაწმენდილი miniSOG-ით ზონდის 3-ის და ლურჯი სინათლის თანდასწრებით, რაც იძლევა პროდუქტებს მასის ცვლაზე +247 და +229 Da, როდესაც აღმოჩენილია LC-MS (ნახ. 2e).).შესამოწმებლად შეიძლებოდა თუ არა ურთიერთქმედება პროქსიმალური პროტეინების მარკირება in vitro miniSOG ფოტოაქტივაციის საპასუხოდ, ჩვენ შევქმენით ხელოვნური სიახლოვის ანალიზი miniSOG-6xHis პროტეინისა და ანტი-His მონოკლონური ანტისხეულის in vitro ურთიერთქმედებით (სურათი 2f).ამ ანალიზში ჩვენ ველოდით ანტისხეულების მძიმე და მსუბუქი ჯაჭვების პროქსიმალურ მარკირებას miniSOG-ით.სინამდვილეში, ანტი-თაგვის (ანტი-6xHis-ის ეტიკეტირებული ანტისხეულების მძიმე და მსუბუქი ჯაჭვების ამოცნობა) და სტრეპტავიდინის Western blots-მა აჩვენა მძიმე და მსუბუქი ჯაჭვების ძლიერი ბიოტინილაცია.აღსანიშნავია, რომ ჩვენ შევამჩნიეთ miniSOG ავტობიოტინილაცია 6xHis ტეგის და ჯვარედინი კავშირების გამო მსუბუქ და მძიმე ჯაჭვებს შორის, რაც შეიძლება დაკავშირებული იყოს ადრე აღწერილ უფსკრულით ლიზინსა და 2-ოქსო-ჰისტიდინის პროქსიმალურ პასუხს შორის.დასასრულს, ჩვენ ვასკვნით, რომ PDPL ცვლის ჰისტიდინს სიახლოვეზე დამოკიდებული გზით.
ჩვენი შემდეგი მიზანი იყო უჯრედქვეშა პროტეომის დახასიათება in situ მარკირების სპეციფიკის შესამოწმებლად.ამიტომ, ჩვენ სტაბილურად გამოვხატეთ miniSOG ბირთვში, მიტოქონდრიულ მატრიქსში ან HEK293T უჯრედების გარე ER მემბრანაში (ნახ. 3a).გელის ფლუორესცენციის ანალიზმა გამოავლინა უხვი ეტიკეტირებული ზოლები სამ სუბუჯრედულ ადგილას, ისევე როგორც სხვადასხვა მარკირების ნიმუშები (ნახ. 3b).ფლუორესცენტული გამოსახულების ანალიზმა აჩვენა PDPL-ის მაღალი სპეციფიკა (ნახ. 3c).PDPL სამუშაო პროცესს მოჰყვა დაწკაპუნების რეაქციები როდამინის საღებავებით უჯრედული პროტეომების გამოსაყოფად ფლუორესცენტული მიკროსკოპის გამოყენებით და PDPL სიგნალები კოლოკალიზებული იყო DAPI, მიტოქონდრიული ტრეკერებით ან ER ტრეკერებით, რაც ადასტურებს PDPL-ის მაღალ ერთგულებას.ორგანელის სამი მდებარეობისთვის, PDPL-ის გვერდიგვერდ შედარება TurboID-თან ავიდინის ვესტერნ ბლოტის გამოყენებით აჩვენა, რომ PDPL უფრო კონკრეტულად იყო მარკირებული მათ შესაბამის კონტროლებთან შედარებით.PDPL-ის პირობებში, უფრო მეტი მარკირებული ზოლები გამოჩნდა, რაც მიუთითებს უფრო მეტ PDPL-ზე მარკირებულ ცილებზე (დამატებითი სურ. 6a-d).
miniSOG-ის შუამავლობით ორგანელების სპეციფიკური პროტეომის ეტიკეტირების სქემატური წარმოდგენა.miniSOG მიზნად ისახავს მიტოქონდრიულ მატრიქსს ადამიანის COX4-ის N-ტერმინალურ 23 ამინომჟავასთან შერწყმის გზით (მიტო-მინიSOG), ბირთვს H2B-თან შერწყმის გზით (ბირთვი-miniSOG) და Sec61β ER მემბრანის ციტოპლაზმური მხარის მეშვეობით (ER-miniSOG). ).ჩვენებები მოიცავს გელის გამოსახულება, კონფოკალური გამოსახულება და მასის სპექტრომეტრია.b წარმომადგენლობითი გელის გამოსახულება სამი ორგანოელისთვის სპეციფიკური PDPL პროფილის.CBB Coomassie ბრწყინვალე ლურჯი.c HEK293T უჯრედების წარმომადგენლობითი კონფოკალური გამოსახულებები, რომლებიც სტაბილურად გამოხატავენ miniSOG-ს სხვადასხვა სუბუჯრედული ლოკალიზაციით, გამოვლენილი ანტისხეულით, მარკირებული V5 (წითელი).უჯრედქვეშა მარკერები გამოიყენება მიტოქონდრიისთვის და ER (მწვანე).PDPL სამუშაო ნაკადი მოიცავს miniSOG (ყვითელი) მარკირებული სუბუჯრედული პროტეომების აღმოჩენას Cy3-azide click ქიმიის გამოყენებით.მასშტაბის ზოლი: 10 μm.d PDPL-ით მონიშნული პროტეომების ვულკანური ნაკვეთები სხვადასხვა ორგანელებში, რაოდენობრივად განსაზღვრულია არალეგირებული რაოდენობებით (n = 3 დამოუკიდებელი ბიოლოგიური ექსპერიმენტი).ვულკანის ნაკვეთებზე გამოყენებული იქნა ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტი.უარყოფითი კონტროლის სახით გამოიყენეს HEK293T ველური ტიპი. მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილები მონიშნულია წითლად (p <0.05 და >2-ჯერადი იონის ინტენსივობის სხვაობა). მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილები მონიშნულია წითლად (p <0.05 და >2-ჯერადი იონის ინტენსივობის სხვაობა). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 და >2-кратная разница в интензивности јонов). მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილები ხაზგასმულია წითლად (p <0.05 და >2-ჯერ სხვაობა იონის ინტენსივობაში).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в јоной силе). მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილები ხაზგასმულია წითლად (p <0.05 და > 2-ჯერ განსხვავება იონურ სიძლიერეში).დაკავშირებული პროტეინები, რომლებიც მნიშვნელოვანია HEK293T-miniSOG-სთვის, მაგრამ არა მნიშვნელოვანი HEK293T-სთვის, ნაჩვენებია მწვანეში.e ექსპერიმენტებიდან პროტეომიური მონაცემთა ნაკრების სპეციფიკის ანალიზი დ.ყოველ ორგანელაში სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი ცილების მთლიანი რაოდენობა (წითელი და მწვანე წერტილები) აღინიშნება ზევით.ჰისტოგრამები აჩვენებს ორგანელებში ლოკალიზებულ პროტეინებს MitoCarta 3.0, GO ანალიზისა და A. Ting et al.ხალხი.ცალკეული მონაცემთა ნაკრები მიტოქონდრიებისთვის, ბირთვებისთვის და ER.ეს ექსპერიმენტები დამოუკიდებლად განმეორდა სულ მცირე ორჯერ მსგავსი შედეგებით.ნედლეული მონაცემები მოწოდებულია ნედლეული მონაცემთა ფაილების სახით.
გელისა და ვიზუალიზაციის შედეგებით წახალისებული, ეტიკეტების გარეშე რაოდენობრივი განსაზღვრა გამოიყენებოდა თითოეულ ორგანელაში იდენტიფიცირებული პროტეომის რაოდენობრივი დასადგენად (დამატებითი მონაცემები 2).არატრანსინფიცირებული HEK293T გამოიყენებოდა, როგორც უარყოფითი კონტროლი ფონის მარკერების გამოკლებისთვის. ვულკანის ნაკვეთის ანალიზმა აჩვენა მნიშვნელოვნად გამდიდრებული პროტეინები (p < 0.05 და >2-ჯერადი იონის ინტენსივობა), ისევე როგორც ერთტონიანი ცილები, რომლებიც მხოლოდ miniSOG-ის გამოხატულ ხაზებშია (ნახ. 3d წითელი და მწვანე წერტილები). ვულკანის ნაკვეთის ანალიზმა აჩვენა მნიშვნელოვნად გამდიდრებული პროტეინები (p < 0.05 და >2-ჯერადი იონის ინტენსივობა), ისევე როგორც ერთტონიანი ცილები, რომლებიც მხოლოდ miniSOG-ის გამოხატულ ხაზებშია (ნახ. 3d წითელი და მწვანე წერტილები). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 და > 2-кратная интенсивность ионов), а также неочные бели белки, которые присутствуют только в линиях, экспресию. ვულკანის ნაკვეთის ანალიზმა აჩვენა მნიშვნელოვნად გამდიდრებული პროტეინები (p<0.05 და >2-ჯერადი იონის ინტენსივობა), ისევე როგორც ცალკეული პროტეინები, რომლებიც მხოლოდ miniSOG-ის გამოხატულ ხაზებშია (ნახ. 3d, წითელი და მწვანე წერტილები)... Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 და> 2x ionnaya ძალა), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG и.красн. ვულკანის ნაკვეთის ანალიზმა გამოავლინა მნიშვნელოვნად გამდიდრებული პროტეინები (p<0.05 და >2x იონური სიძლიერე), ისევე როგორც ცალკეული პროტეინები მხოლოდ miniSOG გამოხატვის ხაზში (წითელი და მწვანე წერტილები ნახ. 3d).ამ მონაცემების კომბინაციით, ჩვენ გამოვავლინეთ 1364, 461 და 911 სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი ბირთვული, მიტოქონდრიული და ER გარე მემბრანის ცილები, შესაბამისად.ორგანელებით ლოკალიზებული PDPL-ის სიზუსტის გასაანალიზებლად გამოვიყენეთ MitoCarta 3.0, გენის ონტოლოგიის (GO) ანალიზი და A. Ting et al.მონაცემთა ნაკრები8 იქნა გამოყენებული მიტოქონდრიისთვის, ბირთვისთვის და ER-სთვის, რათა გამოსცადეს აღმოჩენილი ცილების ორგანელური სპეციფიკა, რომელიც შეესაბამება 73.4, 78.5 და 73.0% სიზუსტეს (ნახ. 3e).PDPL-ის სპეციფიკა ადასტურებს, რომ PDPL იდეალური საშუალებაა ორგანელას სპეციფიკური პროტეომების იდენტიფიცირებისთვის.აღსანიშნავია, რომ იდენტიფიცირებული მიტოქონდრიული ცილების სუბოქონდრიულმა ანალიზმა აჩვენა, რომ დაჭერილი პროტეომი ძირითადად ნაწილდება მატრიქსსა და შიდა მემბრანაში (226 და 106, შესაბამისად), რაც შეადგენს იდენტიფიცირებული მიტოქონდრიული ცილების მთლიანი რაოდენობის 91.7%-ს (362).PDPL-ის მაღალი დონე დამატებით დადასტურდა (დამატებითი სურ. 7a).ანალოგიურად, სუბბირთვულმა ანალიზმა აჩვენა, რომ დატყვევებული პროტეომი ძირითადად განაწილებული იყო ბირთვში, ნუკლეოპლაზმაში და ნუკლეოლში (დამატებითი სურ. 7b).ბირთვული პროტეომიური ანალიზი ბირთვული ლოკალიზაციის სასიგნალო პეპტიდით (3xNLS) აჩვენა მსგავსი სიზუსტე H2B კონსტრუქციისა (დამატებითი სურ. 7c–h).PDPL მარკერის სპეციფიკის დასადგენად, ბირთვული ლამინინი A შეირჩა, როგორც უფრო დისკრეტულად ლოკალიზებული POI7 ხაფანგი.PDPL-მ გამოავლინა 36 მნიშვნელოვნად გამდიდრებული ცილა, რომელთაგან 12 ცილა (30.0% ლამინის A ჩათვლით) იყო კარგად დამახასიათებელი ლამინის A ურთიერთქმედების პროტეინები, რომლებიც ანოტირებულია String მონაცემთა ბაზის მიერ, უფრო მაღალი პროცენტით, ვიდრე BioID მეთოდი (122 ცილა) 28-დან 28. , 22.9. %) 7. ჩვენმა მეთოდმა გამოავლინა ნაკლები ცილა, შესაძლოა, შეზღუდული მარკირების არეების გამო, რაც შესაძლებელი გახდა უფრო აქტიური ერთჯერადი ჟანგბადით.GO ანალიზმა აჩვენა, რომ იდენტიფიცირებული ცილები ძირითადად განლაგებულია ნუკლეოპლაზმაში (26), ბირთვულ მემბრანაში (10), ბირთვულ მემბრანაში (9) და ბირთვულ ფორებში (5).ერთობლივად, ეს ბირთვული ლოკალიზებული პროტეინები შეადგენდა გამდიდრებული ცილების 80%-ს, რაც კიდევ უფრო აჩვენებს PDPL-ის სპეციფიკას (დამატებითი სურ. 8a–d).
მას შემდეგ, რაც დავადგინეთ PDPL-ის უნარი, შეასრულოს სიახლოვის მარკირება ორგანელებში, ჩვენ შევამოწმეთ, შეიძლებოდა თუ არა PDPL-ის გამოყენება POI დამაკავშირებელი პარტნიორების გასაანალიზებლად.კერძოდ, ჩვენ ვცდილობდით განვსაზღვროთ ციტოზოლური ცილების PDPL ანალიზი, რომლებიც განიხილება უფრო რთულ სამიზნეებად, ვიდრე მათი მემბრანული ლოკალიზებული კოლეგები მათი მაღალი დინამიური ბუნების გამო.ბრომოდომენი და ექსტრატერმინალური (BET) პროტეინი BRD4 მიიპყრო ჩვენი ყურადღება სხვადასხვა დაავადებებში მისი მთავარი როლის გამო 35, 36.BRD4-ის მიერ წარმოქმნილი კომპლექსი არის ტრანსკრიპციული კოაქტივატორი და მნიშვნელოვანი თერაპიული სამიზნე.c-myc და Wnt5a ტრანსკრიფციის ფაქტორების გამოხატვის რეგულირებით, BRD4 ითვლება მწვავე მიელოიდური ლეიკემიის (AML), მრავლობითი მიელომას, ბურკიტის ლიმფომის, მსხვილი ნაწლავის კიბოს და ანთებითი დაავადებების ძირითად განმსაზღვრელ ფაქტორად37,38.გარდა ამისა, ზოგიერთი ვირუსი მიზნად ისახავს BRD4-ს ვირუსული და უჯრედული ტრანსკრიფციის დასარეგულირებლად, როგორიცაა პაპილომავირუსი, აივ და SARS-CoV-236,39.
BRD4-ის ურთიერთქმედების გამოსასახად PDPL-ის გამოყენებით, ჩვენ გავაერთიანეთ miniSOG BRD4-ის მოკლე N- ან C-ტერმინალური იზოფორმით.პროტეომიურმა შედეგებმა გამოავლინა გადახურვის მაღალი ხარისხი ორ კონსტრუქტს შორის (დამატებითი სურ. 9a).ბირთვული პროტეომა, რომელიც იდენტიფიცირებულია miniSOG-H2B-თან, მოიცავს BRD4-თან ურთიერთქმედების მქონე ცილების 77.6%-ს (დამატებითი სურ. 9b).შემდეგ, განათების სხვადასხვა დრო (2, 5, 10, 20 წთ) გამოიყენეს მარკერის რადიუსის დასარეგულირებლად (ნახ. 4a და დამატებითი მონაცემები 3).ჩვენ ვასკვნით, რომ მოკლე ფოტოპერიოდებში PDPL უპირველეს ყოვლისა მონიშნავს პირდაპირ შეკავშირებულ პარტნიორებს, ხოლო უფრო გრძელი პერიოდები მოიცავს ცილებს, რომლებიც იდენტიფიცირებულნი არიან მოკლე ფოტოაქტივაციის პერიოდებში, ისევე როგორც ირიბი სამიზნეები მარკირების კომპლექსებში.სინამდვილეში, ჩვენ აღმოვაჩინეთ ძლიერი გადახურვა მიმდებარე დროის წერტილებს შორის (84.6% 2 და 5 წთ; 87.7% 5 და 10 წთ; 98.7% 10 და 20 წთ) (ნახ. 4b და დამატებითი ნახ. 9c).ყველა ექსპერიმენტულ ჯგუფში აღმოვაჩინეთ არა მხოლოდ BRD4 თვით მარკირება, არამედ რამდენიმე ცნობილი სამიზნე, როგორიცაა MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A და HMGB1 ანოტირებული სტრიქონების მონაცემთა ბაზაში.ამ სამიზნეების იონური სიძლიერე ექსპოზიციის დროის პროპორციულია (ნახ. 4c და დამატებითი ნახ. 9დ).2-წუთიან ჯგუფში გამოვლენილი ცილების GO ანალიზმა აჩვენა, რომ იდენტიფიცირებული ცილები ლოკალიზებულია ბირთვში და მონაწილეობდნენ ქრომატინის რემოდელირებასა და რნმ პოლიმერაზას ფუნქციაში.ცილის მოლეკულური ფუნქცია გამდიდრდა ქრომატინის შებოჭვით ან ტრანსკრიპციული კოაქტივაციით, რაც შეესაბამება BRD4 ფუნქციას (ნახ. 4d).სტრიქონის მონაცემთა ბაზაზე ჩართული ცილის ურთიერთქმედების ანალიზმა გამოავლინა არაპირდაპირი ურთიერთქმედების პირველი დონე BRD4 და HDAC ოჯახის ურთიერთქმედების კომპლექსებს შორის, როგორიცაა SIN3A, NCOR2, BCOR და SAP130 (ნახ. 4e და დამატებითი სურ. 9e), რომელიც შეესაბამება BRD4 და HDAC შემაკავშირებელ აცეტილირებულ ჰისტონებს. ..გარდა ამისა, LC-MS/MS მიერ იდენტიფიცირებული წარმომადგენლობითი სამიზნეები, მათ შორის Sin3A, NSUN2, Fus და SFPQ, დადასტურდა Western blotting-ით (ნახ. 4f).ახლახან დაფიქსირდა BRD4-ის მოკლე იზოფორმი, რომელიც ქმნის ბირთვებს თხევადი-თხევადი ფაზის გამოყოფის (LLPS) თვისებებით.რნმ-ის დამაკავშირებელი პროტეინები Fus და SFPQ შუამავლობენ სხვადასხვა უჯრედული პროცესების LLPS-ს და აქ იდენტიფიცირებულია, როგორც დაუწერელი BRD4-ის დამაკავშირებელი პროტეინები.BRD4-სა და SFPQ-ს შორის ურთიერთქმედება დადასტურდა ერთობლივი იმუნოპრეციპიტაციის (co-IP) ექსპერიმენტებით (სურათი 4გ), რაც მიუთითებს BRD4-ის შუამავლობით თხევადი-თხევადი ფაზის გამოყოფის სხვა მექანიზმზე, რომელიც იმსახურებს შემდგომ გამოკვლევას.ერთად აღებული, ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ PDPL არის იდეალური პლატფორმა ცნობილი BRD4 ურთიერთქმედების და ასევე უცნობი შემაკავშირებელი ცილების იდენტიფიცირებისთვის.
miniSOG შუამავლობით BRD4 სიახლოვის მარკირების სქემატური წარმოდგენა, ექსპოზიციის დრო: 2, 5, 10 და 20 წთ.b ცილების გადაფარვა, რომლებიც იდენტიფიცირებულია განათების სხვადასხვა დროს.HEK293T-miniSOG-BRD4-ში გამოვლენილი პროტეინის გამდიდრება სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი იყო ველური ტიპის HEK293T-თან შედარებით.c იონის ინტენსივობა, როდესაც რაოდენობრივად ადგენენ არა მარკირებული წარმომადგენლობითი ცნობილი BRD4-შემაკავშირებელ ცილებს ექსპოზიციის მითითებულ დროს.n = 3 ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი ნიმუში.მონაცემები წარმოდგენილია საშუალოდ ± სტანდარტული გადახრის სახით.d 2-წუთიან ჯგუფში გამოვლენილი ცილების გენის ონტოლოგიური ანალიზი (GO).ჩამოთვლილია პირველი ათი GO ტერმინი.ბუშტები შეფერილია GO ტერმინის კატეგორიის მიხედვით და ბუშტის ზომა პროპორციულია თითოეულ ტერმინში ნაპოვნი ცილების რაოდენობის მიხედვით.e ცილების სიმებიანი ანალიზი, რომლებიც ურთიერთქმედებენ BRD4-თან.ყვითელი წრეები პირდაპირი წებოა, ხოლო ნაცრისფერი წრეები არაპირდაპირი წებოს პირველი ფენაა.წითელი ხაზები წარმოადგენს ექსპერიმენტულად განსაზღვრულ ურთიერთქმედებებს, ხოლო ლურჯი ხაზები წარმოადგენს წინასწარმეტყველურ ურთიერთქმედებებს.f LC-MS/MS-ში იდენტიფიცირებული BRD4-ის დამაკავშირებელი სამიზნეები დამოწმებული იყო Western blotting-ით.გ ერთობლივი იმუნოპრეციპიტაციის ექსპერიმენტები ადასტურებს ურთიერთქმედებას SFPQ-სა და BRD4-ს შორის.ეს ექსპერიმენტები დამოუკიდებლად განმეორდა სულ მცირე ორჯერ მსგავსი შედეგებით.ნედლეული მონაცემები მოწოდებულია ნედლეული მონაცემთა ფაილების სახით.
გარდა არარეგისტრირებული POI-თან ასოცირებული სამიზნეების იდენტიფიკაციისა, ჩვენ ვარაუდობთ, რომ PDPL შესაფერისი იქნება ფერმენტების სუბსტრატების იდენტიფიცირებისთვის, რაც მოითხოვს არაპირდაპირი დამაკავშირებელი ცილების დახასიათებას დიდ კომპლექსებში არარეგისტრირებული სუბსტრატების ანოტაციისთვის.პარკინი (დაშიფრულია PARK2-ით) არის E3 ლიგაზა და პარკინში არსებული მუტაციები, როგორც ცნობილია, იწვევს აუტოსომურ რეცესიულ არასრულწლოვან პარკინსონის დაავადებას (AR-JP)42.გარდა ამისა, პარკინი აღწერილია, როგორც აუცილებელი მიტოფაგიისთვის (მიტოქონდრიული აუტოფაგია) და რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების მოცილებისთვის.თუმცა, მიუხედავად იმისა, რომ გამოვლენილია პარკინის რამდენიმე სუბსტრატი, პარკინის როლი ამ დაავადებაში გაურკვეველი რჩება.მისი დაუხასიათებელი სუბსტრატების ანოტაციისთვის, PDPL შემოწმდა miniSOG-ის დამატებით პარკინის N- ან C-ბოლოზე.უჯრედები დამუშავდა კარბონილის ციანიდის პროტონის გადამტანი m-ქლოროფენილჰიდრაზონით (CCCP) პარკინის გასააქტიურებლად PINK1-Parkin გზის მეშვეობით.ჩვენს BRD4 PDPL შედეგებთან შედარებით, პარკინის N-დაბოლოების შერწყმა გამოავლინა სამიზნე ცილების უფრო დიდი ნაკრები, თუმცა ის ფარავდა C-ტერმინალის უფრო დიდ ნაწილს (177 210-დან) (სურათი 5a,b და დამატებითი მონაცემები 4).შედეგი შეესაბამება ცნობებს, რომ N-ტერმინალის ტეგებს შეუძლია შეუცვლელად გაააქტიუროს Parkin44.გასაკვირია, რომ ჩვენს მონაცემებში იყო მხოლოდ 18 გადახურული ცილა პარკინ43-ისთვის გამოქვეყნებული AP-MS შედეგებით, სავარაუდოდ უჯრედულ ხაზებსა და პროტეომიკის სამუშაო ნაკადებს შორის განსხვავებების გამო.გარდა ოთხი ცნობილი პროტეინის (ARDM1, HSPA8, PSMD14 და PSMC3), იდენტიფიცირებული ორი მეთოდით (ნახ. 5c)43.LC-MS/MS-ის შედეგების შემდგომი დასადასტურებლად, PDPL მკურნალობა და შემდგომი Western blotting გამოყენებული იქნა HEK293T მშობელი უჯრედების ანალიზისა და სტაბილური N-ტერმინალური პარკინის ხაზის შედეგების შესადარებლად.ადრე უცნობი სამიზნეები CDK2, DUT, CTBP1 და PSMC4 ტესტირებულ იქნა ცნობილი შემკვრელით, DNAJB1 (ნახ. 5d).
ვულკანური დიაგრამა პარკინთან ურთიერთქმედების პროტეინებში HEK293T უჯრედებში სტაბილურად გამოხატული miniSOG-ით შერწყმული პარკინის N- ან C-ბოლოსთან (n = 3 დამოუკიდებელი ბიოლოგიური ექსპერიმენტი).ვულკანის ნაკვეთებზე გამოყენებული იქნა ორკუდიანი სტუდენტის t-ტესტი.HEK293T გამოიყენებოდა როგორც უარყოფითი კონტროლი. მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილები მონიშნულია წითლად (p <0.05 და >2-ჯერადი იონის ინტენსივობის სხვაობა). მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილები მონიშნულია წითლად (p <0.05 და >2-ჯერადი იონის ინტენსივობის სხვაობა). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 და >2-кратная разница в интензивности јонов). მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილები ხაზგასმულია წითლად (p <0.05 და >2-ჯერ სხვაობა იონის ინტენსივობაში).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в јоной силе). მნიშვნელოვნად შეცვლილი ცილები ხაზგასმულია წითლად (p <0.05 და > 2-ჯერ განსხვავება იონურ სიძლიერეში).დაკავშირებული პროტეინები, რომლებიც მნიშვნელოვანია HEK293T-miniSOG-სთვის, მაგრამ არა მნიშვნელოვანი HEK293T-სთვის, ნაჩვენებია მწვანეში.b ვენის დიაგრამა, რომელიც გვიჩვენებს გადახურულ ცილებს N-ტერმინალურ და C-ტერმინალურ კონსტრუქტებს შორის.N-ტერმინალის ტეგებს შეუძლია არასწორად გაააქტიუროს პარკინი და გამოიწვიოს უფრო ცნობადი ცილები.c ვენის დიაგრამა, რომელიც გვიჩვენებს გადაფარვის პროტეინებს PDPL-სა და AP-MS-ს შორის.ჩამოთვლილია ცნობილი ინტერაქტორები, მათ შორის 18 გადაფარვითი ცილებიდან 4 და PDPL-ში სპეციალურად გამოვლენილი 159 ცილიდან 11.d LC-MS/MS-ით გამოვლენილი წარმომადგენლობითი სამიზნეები დამოწმებული იქნა Western blotting-ით.e Ssu72 და SNW1 იყო იდენტიფიცირებული, როგორც არარეგისტრირებული პარკინის სუბსტრატები.ეს FLAG-ით მონიშნული ცილოვანი პლაზმიდები გადაიზარდა HEK293T-ში და HEK293T-Parkin-miniSOG-ში, რასაც მოჰყვა CCCP მკურნალობა სხვადასხვა დროს.დეგრადაცია უფრო გამოხატული იყო პარკინის გადაჭარბებული გამოხატვის ხაზში.f პროტეაზომის ინჰიბიტორი MG132-ის გამოყენებით დადასტურდა, რომ Ssu72-ისა და SNW1-ის დეგრადაციის პროცესი შუამავლობს პროტეასომა-უბიქვიტინაციით.ეს ექსპერიმენტები დამოუკიდებლად განმეორდა სულ მცირე ორჯერ მსგავსი შედეგებით.ნედლეული მონაცემები მოწოდებულია ნედლეული მონაცემთა ფაილების სახით.
აღსანიშნავია, რომ PDPL-ის მიერ იდენტიფიცირებული პროტეინები უნდა შეიცავდეს პარკინს დამაკავშირებელ ცილებს და მათ სუბსტრატებს.არარეგისტრირებული პარკინის სუბსტრატების გამოსავლენად, ჩვენ შევარჩიეთ შვიდი იდენტიფიცირებული ცილა (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 და SNW1) და ტრანსფექციული პლაზმიდები, რათა გამოეჩინათ ეს გენები ნორმალური HEK293T და სტაბილურად გამოხატონ miniSOG-Parkin-ის CPCC9 მკურნალობა, რასაც მოჰყვა HEK2.Ssu72 და SNW1 ცილების დონეები მნიშვნელოვნად შემცირდა სტაბილურ miniSOG-Parkin ხაზში (ნახ. 5e).CCCP 12 საათის განმავლობაში მკურნალობამ გამოიწვია ორივე სუბსტრატის ყველაზე მნიშვნელოვანი დეგრადაცია.იმის გამოსაკვლევად, რეგულირდება თუ არა Ssu72-ისა და SNW1-ის დეგრადაცია პროტეასომა-უბიქვიტინაციით, პროტეაზომის ინჰიბიტორი MG132 დაემატა პროტეაზომის აქტივობის დასათრგუნად და, ფაქტობრივად, აღმოვაჩინეთ, რომ მათი დეგრადაციის პროცესი დათრგუნული იყო (ნახ. 5f).დამატებითი არასუბსტრატის სამიზნეები დადასტურებული იყო, როგორც პარკინის ინტერაქტორები Western blotting-ის გამოყენებით (დამატებითი სურ. 10), რომელიც აჩვენებდა თანმიმდევრულ შედეგებს LC-MS/MS-თან.დასასრულს, PDPL სამუშაო ნაკადის ინტეგრაცია სამიზნე ცილის ტრანსფექციის შემოწმებასთან იძლევა არარეგისტრირებული E3 ლიგაზას სუბსტრატების იდენტიფიკაციის საშუალებას.
ჩვენ შევიმუშავეთ საერთო სიახლოვის მარკირების პლატფორმა, რომელიც საშუალებას გაძლევთ ამოიცნოთ სივრცეში და დროში ურთიერთქმედების POI.პლატფორმა დაფუძნებულია miniSOG ფოტომგრძნობიარე ცილაზე, რომელიც არის მხოლოდ დაახლოებით 12 kDa, ნახევარზე ნაკლები მომწიფებული APEX2 ფერმენტის (27 kDa) ზომისა და TurboID-ის ზომის მესამედი (35 kDa).მცირე ზომამ მნიშვნელოვნად უნდა გააფართოოს აპლიკაციების სპექტრი მცირე ცილის ინტერაქტომების შესასწავლად.დამატებითი ფოტოსენსიბილიზატორების შემდგომი გამოკვლევა, იქნება ეს გენეტიკურად კოდირებული ცილები თუ მცირე მოლეკულები, საჭიროა ჟანგბადის კვანტური გამოსავლიანობის გაზრდისა და ამ მიდგომის მგრძნობელობის გასაფართოებლად.miniSOG-ის მიმდინარე ვერსიისთვის, მაღალი დროითი გარჩევადობის მიღწევა შესაძლებელია ლურჯი განათების გამოყენებით სიახლოვის მარკერების გასააქტიურებლად.გარდა ამისა, ხანგრძლივმა ექსპოზიციამ გაათავისუფლა ერთიანი ჟანგბადის უფრო დიდი „ღრუბელი“, რის შედეგადაც მოდიფიცირებულია უფრო დისტალური ჰისტიდინის ნარჩენები, გაიზარდა მარკირების რადიუსი და PDPL სივრცითი გარჩევადობის დაზუსტების შესაძლებლობა.ჩვენ ასევე გამოვცადეთ შვიდი ქიმიური ზონდი, რათა გაზარდოთ სიგნალი-ფონის თანაფარდობა და გამოვიკვლიეთ მოლეკულური მექანიზმი ამ მიდგომის უკან.TOP-ABPP სამუშაო პროცესმა მიუკერძოებელ ღია ძიებასთან ერთად დაადასტურა, რომ ცვლილებები მოხდა მხოლოდ ჰისტიდინებში და არ შეინიშნებოდა თანმიმდევრული მიკროგარემო ჰისტიდინის გაზრდილი მოდიფიკაციებისთვის, გარდა მარყუჟის რეგიონში ჰისტიდინების ზომიერი უპირატესობისა.
PDPL ასევე გამოიყენებოდა უჯრედქვეშა პროტეომების დასახასიათებლად პროტეომის სპეციფიკურობითა და დაფარვით, სულ მცირე, შედარებული სხვა სიახლოვის მარკირებისა და ორგანელას სპეციფიკური ქიმიური გამოკვლევის მეთოდებთან.სიახლოვის მარკერები ასევე წარმატებით იქნა გამოყენებული ზედაპირული, ლიზოსომური და სეკრეტომთან დაკავშირებული პროტეომების დასახასიათებლად46,47.ჩვენ გვჯერა, რომ PDPL თავსებადი იქნება ამ უჯრედულ ორგანელებთან.გარდა ამისა, ჩვენ დავუპირისპირდით PDPL-ს ციტოზოლური ცილებთან შეკავშირების სამიზნეების იდენტიფიცირებით, რომლებიც უფრო რთულია ვიდრე მემბრანასთან დაკავშირებული პროტეინები მათი დინამიური თვისებებისა და უფრო დროებით ურთიერთქმედებებში მონაწილეობის გამო.PDPL გამოყენებული იქნა ორ ცილაზე, ტრანსკრიპციულ კოაქტივატორ BRD4-ზე და დაავადებასთან ასოცირებულ ლიგაზა E3 Parkin-ზე.ეს ორი ცილა შეირჩა არა მხოლოდ მათი ფუნდამენტური ბიოლოგიური ფუნქციებისთვის, არამედ მათი კლინიკური შესაბამისობისა და თერაპიული პოტენციალის გამო.ამ ორი POI-სთვის იდენტიფიცირებული იყო ცნობილი სავალდებულო პარტნიორები და ასევე არარეგისტრირებული სამიზნეები.აღსანიშნავია, რომ ფაზის განცალკევებასთან ასოცირებული ცილა SFPQ დადასტურდა co-IP-ით, რაც შეიძლება მიუთითებდეს ახალ მექანიზმზე, რომლითაც BRD4 (მოკლე იზოფორმა) არეგულირებს LLPS-ს.ამავდროულად, მიგვაჩნია, რომ პარკინის სუბსტრატების იდენტიფიკაცია არის სცენარი, რომელშიც საჭიროა არაპირდაპირი ადჰეზივების იდენტიფიცირება.ჩვენ გამოვავლინეთ პარკინის ორი დაუდგენელი სუბსტრატი და დავადასტურეთ მათი დეგრადაცია უბიკვიტინაცია-პროტეაზომის გზის გასწვრივ.ახლახან შემუშავდა მექანიზმზე დაფუძნებული დაჭერის სტრატეგია ჰიდროლაზის სუბსტრატების გამოსავლენად მათი ფერმენტებით დაჭერით.მიუხედავად იმისა, რომ ეს ძალიან ძლიერი მეთოდია, ის არ არის შესაფერისი სუბსტრატების ანალიზისთვის, რომლებიც მონაწილეობენ დიდი კომპლექსების წარმოქმნაში და მოითხოვს კოვალენტური ბმების ფორმირებას ფერმენტსა და სუბსტრატს შორის.ჩვენ ველით, რომ PDPL შეიძლება გაფართოვდეს სხვა ცილოვანი კომპლექსებისა და ფერმენტების ოჯახების შესასწავლად, როგორიცაა დეუბიქვიტინაზა და მეტალოპროტეაზას ოჯახები.
miniSOG-ის ახალი ფორმა, სახელწოდებით SOPP3, შეიქმნა ჟანგბადის გაუმჯობესებული ერთჯერადი გამომუშავებით.ჩვენ შევადარეთ miniSOG SOPP3-ს და აღმოვაჩინეთ მარკირების გაუმჯობესებული შესრულება, თუმცა სიგნალი-ხმაურის თანაფარდობა უცვლელი დარჩა (დამატებითი სურ. 11).ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ SOPP3-ის ოპტიმიზაცია (მაგ., მიმართული ევოლუციის გზით) გამოიწვევდა უფრო ეფექტურ ფოტომგრძნობიარე პროტეინებს, რომლებიც საჭიროებენ სინათლის ხანმოკლე დროებს და, შესაბამისად, უფრო დინამიური უჯრედული პროცესების დაფიქსირებას.აღსანიშნავია, რომ PDPL-ის ამჟამინდელი ვერსია შემოიფარგლება ფიჭური გარემოთი, რადგან ის მოითხოვს ლურჯი შუქის განათებას და არ შეუძლია ღრმა ქსოვილებში შეღწევა.ეს ფუნქცია გამორიცხავს მის გამოყენებას ცხოველთა მოდელების კვლევებში.თუმცა, ოპტოგენეტიკის კომბინაციამ PDPL-თან შეიძლება უზრუნველყოს ცხოველების კვლევის შესაძლებლობა, განსაკუთრებით თავის ტვინში.გარდა ამისა, სხვა ინჟინერირებული ინფრაწითელი ფოტოსენსიბილიზატორები ასევე ხსნიან ამ შეზღუდვას.ამჟამად ამ მიმართულებით მიმდინარეობს კვლევა.
HEK293T უჯრედული ხაზი მიღებული იყო ATCC-დან (CRL-3216).უჯრედის ხაზი უარყოფითი იყო მიკოპლაზმის ინფექციაზე და კულტივირებული იყო DMEM-ში (თერმო, #C11995500BT), რომელსაც დაემატა 10% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატი (FBS, Vistech, #SE100-B) და 1% პენიცილინი/სტრეპტომიცინი (Hyclone, #SV30010).გაიზარდა.
3-ამინოფენილენი (ნიმუში 3) და (4-ეთინილფენილ)მეთანამინი (ნიმუში 4) შეძენილია Bidepharm-ისგან.პროპილამინი (ზონდი 2) შეძენილია Energy-chemicals-დან.N-(2-ამინოფენილ)პენტ-4-ინამიდი (ზონდი 1) სინთეზირებული იყო გამოქვეყნებული მეთოდების მიხედვით.
დამატებითი ცხრილი 1 ჩამოთვლილია ამ კვლევაში გამოყენებული გენეტიკური კონსტრუქციები.miniSOG და KillerRed თანმიმდევრობები კლონირებული იყო P. Zou-ს (პეკინის უნივერსიტეტის) საჩუქარი პლაზმიდიდან.მიტოქონდრიული მატრიცის სამიზნე თანმიმდევრობა მიღებული იყო COX4-ის 23 N-ტერმინალური ამინომჟავებიდან და კლონირებული იყო მითითებულ ვექტორებში გიბსონის შეკრების გამოყენებით (Beyotime, #D7010S).ენდოპლაზმური ბადის მემბრანისა და ბირთვის დასამიზნებლად, SEC61B ადამიანის დნმ (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) გაძლიერებულია PCR-ით HEK293T უჯრედების cDNA ბიბლიოთეკიდან და H2B დნმ (დონაცია D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) და კლონირებული, როგორც ზემოთ აღინიშნა.თუ სხვაგვარად არ არის მითითებული, სხვა ცილოვანი გენები, რომლებიც გამოიყენება ტრანსფექციისა და სტაბილური უჯრედული ხაზების მშენებლობისთვის, იყო PCR გაძლიერებული HEK293T უჯრედის cDNA ბიბლიოთეკიდან.G3S (GGGS) და G4S (GGGGS) გამოიყენებოდა როგორც დამაკავშირებელი სატყუარას პროტეინსა და miniSOG-ს შორის.ამ შერწყმის კონსტრუქტებს დაემატა V5 ეპიტოპის ტეგი (GKPIPNPLLGLDST).ძუძუმწოვრებში გამოხატვისთვის და სტაბილური უჯრედული ხაზის დასამყარებლად, miniSOG შერწყმის კონსტრუქცია სუბკლონირებული იყო pLX304 ლენტივირუსულ ვექტორში.ბაქტერიული ექსპრესიისთვის, miniSOG იყო კლონირებული pET21a ვექტორში, ეტიკეტირებული 6xHis C-ბოლოზე.
HEK293T უჯრედები დათესეს 2.0 x 105 უჯრედზე თითო ჭაბურღილში ექვს ჭაბურღილიან ფირფიტებში და 24 საათის შემდეგ ტრანსფექციით გადაიყვანეს რეკომბინანტული ლენტივირუსული პლაზმიდებით (2.4 მკგ pLX304) და ვირუსული შეფუთვის პლაზმიდებით (1.5 μg psPAX2 და 1.2 μg psPAX2 და 1.2 μg 0Bepo2-თი) დროში 0Bepo2 გამოყენებით. , #C0533), დაახლოებით 80% შერწყმა.ღამით ტრანსფექციის შემდეგ, გარემო შეიცვალა და ინკუბირებული იყო კიდევ 24 საათის განმავლობაში.ვირუსის შეგროვება განხორციელდა 24, 48 და 72 საათის შემდეგ.სამიზნე უჯრედების ინფიცირებამდე ვირუსული გარემო გაფილტრული იყო 0,8 μm ფილტრის მეშვეობით (Merck, #millex-GP) და დაემატა პოლიბრენი (Solarbio, #H8761) 8 μg/ml კონცენტრაციით.24 საათის შემდეგ, უჯრედებს საშუალება მიეცათ აღდგეს გარემოს შეცვლით.უჯრედები შეირჩა 5 მკგ/მლ ბლასტიციდინის გამოყენებით (Solarbio, #3513-03-9) პირველი სამი პასაჟისთვის, როგორც უფრო დაბალი მკაცრი შერჩევა.შემდეგ გამოიყენეთ 20 μg/ml, როგორც უფრო მკაცრი რეჟიმი მომდევნო სამი პასაჟისთვის.
უჯრედები დათესეს 12 ჭაბურღილ პალატაში (Ibidi, #81201) დაახლოებით 20,000 უჯრედის სიმკვრივით თითო ჭაბურღილში.HEK293T უჯრედების ადჰეზიის გასაუმჯობესებლად, დაამატეთ 50 მკგ/მლ ფიბრონექტინი (Corning, #356008) განზავებული ფოსფატის ბუფერულ ხსნარში (PBS, Sangon, #B640435) 37°C-ზე.კამერები წინასწარ დამუშავდა 1 საათის განმავლობაში და შემდეგ ამოღებულ იქნა PBS-ით.24 საათის შემდეგ, უჯრედები ერთხელ გაირეცხა PBS-ით, ინკუბირებული იქნა 1 მმ ზონდით 3 ახალ ჰენქსის დაბალანსებულ მარილის ხსნარში (HBSS, Gibco, #14025092) 1 საათის განმავლობაში 37°C-ზე და შემდეგ ინკუბირებული იყო ლურჯი LED-ით (460 ნმ. ).) დასხივებული იქნა 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.ამის შემდეგ, უჯრედები ორჯერ გაირეცხა PBS-ით და ფიქსირდება 4% ფორმალდეჰიდით PBS-ში (Sangon, #E672002) 15 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.ჭარბი ფორმალდეჰიდი ამოღებულ იქნა ფიქსირებული უჯრედებიდან სამჯერ გარეცხვით PBS-ით.შემდეგ უჯრედები გაჟღენთილი იყო 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) PBS-ში და გარეცხილი იყო 3-ჯერ PBS-ით.შემდეგ ამოიღეთ კამერა და დაამატეთ თითოეულ ნიმუშს 25 μl დაწკაპუნების რეაქციის ნარევი, რომელიც შეიცავს 50 μM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) და 0.5 მგ/მლ ნატრიუმის ასკორბატი (Aladdin, No. S105024) და ინკუბაცია 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.ვადამდელი რეაქციის შემდეგ, უჯრედები ექვსჯერ გაირეცხა PBS-ით, რომელიც შეიცავს 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) და შემდეგ დაიბლოკა 5% BSA (Abcone, #B24726) PBST-ში 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.
კოლოკალიზაციის იმუნოშეღებვისთვის, უჯრედები ინკუბირებული იყო პირველადი ანტისხეულებით მითითებული პირობების მიხედვით: თაგვის ანტი-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), კურდღლის ანტი-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), კურდღლის პოლიკლონური ანტი-კალნექსინის ანტისხეული (1:500, Abcam, #ab22595) ან კურდღლის ანტი-ლამინის A/C მონოკლონური ანტისხეული (1:500; CST, #2032) 4 °C ღამით.PBST-ით 3-ჯერ გარეცხვის შემდეგ, უჯრედები ინკუბირებული იყო მეორადი ანტისხეულებით: თხის საწინააღმდეგო კურდღლის Alexa Fluor 488 (თერმო, #A11034) განზავებული 1:1000, თხის საწინააღმდეგო თაგვის Alexa Fluor 594 (CST, #8889) განზავებული 1:100.განზავება გააზავეთ ოთახის ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში.უჯრედები შემდეგ გაირეცხა 3-ჯერ PBST-ით და შეღებილი იქნა DAPI (თერმო, #D1306) PBS-ში 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.PBS-ით 3 გამორეცხვის შემდეგ, უჯრედები დალუქული იყო 50%-იან გლიცეროლში (Sangon, #A600232) PBS-ში გამოსახულების მისაღებად.იმუნოფლუორესცენტური გამოსახულებები მიღებულ იქნა ZEISS LSM 900 Airyscan2 კონფოკალური მიკროსკოპის და ZNE 3.5 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
ერთჯერადი ჟანგბადის ფლუორესცენტური გამოსახულების მიზნით, უჯრედები ორჯერ გაირეცხა Hanks HEPES ბუფერით, სანამ დაემატებოდა 100 nM Si-DMA Hanks HEPES ბუფერში (DOJINDO, #MT05).სინათლის ზემოქმედების შემდეგ უჯრედები ინკუბირებული იყო CO2 ინკუბატორში 37°C ტემპერატურაზე 45 წუთის განმავლობაში.შემდეგ უჯრედები ორჯერ გაირეცხა ჰენქსის HEPES ბუფერით და შეღებილი იქნა Hoechst-ით ჰენქსის HEPES ბუფერში 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე და ვიზუალიზებული იქნა ZEISS LSM 900 კონფოკალური მიკროსკოპის გამოყენებით., #M36008) HBSS ბუფერში, რომელიც შეიცავს კალციუმს და მაგნიუმს.სინათლის ან დოქსორუბიცინის (MCE, #HY-15142A) ზემოქმედების შემდეგ უჯრედები ინკუბირებული იყო CO2 ინკუბატორში 37°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში, ორჯერ გარეცხეს HBSS ბუფერით და ინკუბირებული იქნა Hoechst-ით HBSS ბუფერში ოთახის ტემპერატურაზე.წუთები.დოქსორუბიცინი გამოიყენებოდა როგორც დადებითი გამოკვლევის კონტროლი, სადაც უჯრედები მკურნალობდნენ 20 μM დოქსორუბიცინით HBSS-ში, რომელიც შეიცავდა 1% BSA-ს 30 წუთის განმავლობაში.იმუნოფლუორესცენტური გამოსახულებები მიიღეს Zeiss LSM 900 კონფოკალური მიკროსკოპის გამოყენებით.
HEK293T უჯრედები, რომლებიც სტაბილურად გამოხატავენ mito-miniSOG-ს, დათესეს დაახლოებით 30% სიმკვრივით 15 სმ ჭურჭელში.48 საათის შემდეგ, როდესაც მიღწეული იყო ~80% შერწყმა, უჯრედები ერთხელ გაირეცხა PBS-ით, ინკუბირებული იქნა 1 მმ პრობ 3 ახალი HBSS ბუფერში 1 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე და შემდეგ განათდა ლურჯი LED-ით 10 წუთის განმავლობაში ოთახში. ტემპერატურა..ამის შემდეგ, უჯრედები ორჯერ გაირეცხა PBS-ით, გახეხილი და ხელახლა სუსპენდირებულ იქნა ყინულივით ცივ PBS ბუფერში, რომელიც შეიცავს EDTA-განთავისუფლებულ პროტეაზას ინჰიბიტორებს (MCE, #HY-K0011).უჯრედები ლიზიზირებული იყო წვერის გაჟღერებით 1 წუთის განმავლობაში (1 წამი ჩართული და 1 წამი გამორთვა 35% ამპლიტუდაზე).შედეგად მიღებული ნარევი ცენტრიფუგირებულ იქნა 15,871 xg-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე ნარჩენების მოსაშორებლად და ზენატანის კონცენტრაცია დარეგულირდა 4 მგ/მლ-მდე BCA ცილის ანალიზის ნაკრების გამოყენებით (Beyotime, #P0009).შეუთავსეთ ზემოაღნიშნული ლიზატის 1 მლ 0.1 მმ ფოტოდეგრადირებადი ბიოტინ აზიდთან (Confluore, #BBBD-14), 1 მმ TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 მმ TBTA ლიგანდთან (Aladdin, #T162437) და 1 მმ SO4 ინკუბით. როტაცია 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.მყისიერი რეაქციის შემდეგ, დაამატეთ ნარევი წინასწარ შერეულ ხსნარში (MeOH:CHCl3:H2O = 4 მლ:1 მლ:3 მლ) 10 მლ მინის ფლაკონში.ნიმუშები შერეული იყო და ცენტრიფუგირებულ იქნა 4500 გ 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.ქვედა და ზედა ხსნარი გადააგდეს, ნალექი ორჯერ გარეცხეს 1 მლ მეთანოლით და ცენტრიფუგირებულ იქნა 15871 × გ 5 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე.ნალექის გასახსნელად დაამატეთ 1 მლ 8 M შარდოვანა (Aladdin, No. U111902) 25 მმ ამონიუმის ბიკარბონატში (ABC, Aladdin, no. A110539).ნიმუშები აღდგენილი იყო 10 მმ დითიოთრეიტოლით (Sangon, #A100281 25 მმ ABC-ში) 40 წუთის განმავლობაში 55°C-ზე, რასაც მოჰყვა 15 მმ ახალი იოდოაცეტამიდის დამატება (Sangon, #A600539) ოთახის ტემპერატურაზე სიბნელეში.ალკილაცია 30 წუთში..რეაქციის შესაჩერებლად დაემატა დამატებითი 5 მმ დითიოთრეიტოლი.მოამზადეთ დაახლოებით 100 μl ნეიტრაავიდინის აგაროზის მარცვლები (თერმო, #29202) თითოეული ნიმუშისთვის 3-ჯერ გარეცხვით 1 მლ PBS-ით.ზემოაღნიშნული პროტეომის ხსნარი განზავებულია 5 მლ PBS-ით და ინკუბირებული იყო წინასწარ გარეცხილი ნეიტრავიდინის აგაროზის მარცვლებით 4 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.შემდეგ მძივები გარეცხეს 3-ჯერ 5 მლ PBS-ით, რომელიც შეიცავს 0.2% SDS-ს (Sangon, #A600485), 3-ჯერ 5 მლ PBS-ით, რომელიც შეიცავს 1M შარდოვანას და 3-ჯერ 5 მლ ddH2O-ით.შემდეგ მარცვლები დაკრეფილი იქნა ცენტრიფუგირებით და ხელახლა სუსპენდირებულ იქნა 200 μl 25 mM ABC-ში, რომელიც შეიცავდა 1 M შარდოვანას, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) და 20 ng/μl ტრიპსინს (Promega, #V5280).ტრიფსინიზაცია ღამით 37°C ტემპერატურაზე ბრუნვით.რეაქცია შეწყდა ჭიანჭველა მჟავას (თერმო, # A117-50) დამატებით, სანამ pH არ მიაღწევდა 2-3-ს.მძივები გარეცხეს 3-ჯერ 1 მლ PBS-ით, რომელიც შეიცავს 0.2% SDS-ს, 3-ჯერ 1 მლ PBS-ით, რომელიც შეიცავს 1 M შარდოვანას და შემდეგ 3-ჯერ 1 მლ გამოხდილი წყლით.მოდიფიცირებული პეპტიდები გამოიცა მსუბუქი ლიზისით (365 ნმ) 90 წუთის განმავლობაში 200 μl 70% MeOH-ის გამოყენებით.ცენტრიფუგაციის შემდეგ, სუპერნატანი შეგროვდა.შემდეგ მძივები გარეცხეს ერთხელ 100 μl 70% MeOH და ზედმეტად გაერთიანდა.ნიმუშები გაშრეს Speedvac ვაკუუმ კონცენტრატორში და ინახება -20°C-ზე ანალიზამდე.
ერთჯერადი ჟანგბადის მოდიფიცირებული პეპტიდების იდენტიფიცირებისთვის და რაოდენობრივად, ნიმუშები ხელახლა იხსნება 0.1% ჭიანჭველა მჟავაში და 1 მკგ პეპტიდები გაანალიზებულია Orbitrap Fusion Lumos Tribrid მასობრივი სპექტრომეტრის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილია Tune-დან ნანო ESI წყაროთი და Xcalibur-ის გამყიდველი პროგრამული უზრუნველყოფის 4.3-დან.ნიმუშები გამოყოფილი იყო 75 μm × 15 სმ შიგნიდან შეფუთულ კაპილარულ სვეტზე 3 μm C18 მასალით (ReproSil-pur, #r13.b9.) და დაკავშირებული იყო EASY-nLC 1200 UHPLC სისტემასთან (თერმო).პეპტიდები გამოეყო ხაზოვანი 95 წუთიანი გრადიენტური ქრომატოგრაფიით 8% გამხსნელი B-დან 50% გამხსნელ B-მდე (A = 0.1% ჭიანჭველა მჟავა წყალში, B = 0.1% ჭინჭრის მჟავა 80% აცეტონიტრილში), შემდეგ ხაზობრივად გაიზარდა 98% B წთ-მდე. 6 წუთში 300 ნლ/წთ სიჩქარით.Orbitrap Fusion Lumos აგროვებს მონაცემებს მონაცვლეობით სრულ MS სკანირებასა და MS2 სკანირებას შორის, მონაცემების მიხედვით.დაფრქვევის ძაბვა დაყენებული იყო 2.1 კვ-ზე და იონური ტრანსპორტირების კაპილარის ტემპერატურა იყო 320°C.MS სპექტრები (350-2000 მ/ზ) შეგროვდა 120000 გარჩევადობით, AGC 4 × 105 და მაქსიმალური შეყვანის დრო 150 ms.10 ყველაზე გავრცელებული გამრავლებით დამუხტული წინამორბედი ყოველ სრულ სკანირებაში ფრაგმენტირებული იყო HCD-ის გამოყენებით ნორმალიზებული შეჯახების ენერგიით 30%, ოთხპოლუსიანი იზოლაციის ფანჯარა 1.6 მ/ზ და გარჩევადობის პარამეტრი 30,000.AGC სამიზნე ტანდემური მასის სპექტრომეტრიისთვის 5×104 და მაქსიმალური შეყვანის დრო 150 ms.დინამიური გამონაკლისი დაყენებულია 30 წამზე. გამოუყენებელი იონები ან 1+ და >7+ მუხტი იყო უარყოფილი MS/MS-ისთვის. გამოუყენებელი იონები ან 1+ და >7+ მუხტი იყო უარყოფილი MS/MS-ისთვის. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ და >7+ были отклонены для МС/МС. გამოუყენებელი იონები ან იონები მუხტით 1+ და >7+ იყო უარყოფილი MS/MS-ისთვის.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. დაუზუსტებელი იონები ან იონები მუხტით 1+ და >7+ იყო უარყოფილი MS/MS-ისთვის.
ნედლეული მონაცემები მუშავდება FragPipe გამოთვლითი პლატფორმის გამოყენებით, რომელიც დაფუძნებულია MSFragger-ზე.მასის მიკერძოება და შესაბამისი ამინომჟავები განისაზღვრა ღია ძიების ალგორითმის გამოყენებით, წინამორბედის მასის ტოლერანტობით -150-დან 500 Da-მდე.მოდიფიცირებული პეპტიდები შემდეგ იქნა იდენტიფიცირებული ჰისტიდინის მოდიფიკაციების გამოყენებით მასის მომატებით +229,0964 და +247,1069 Da PD-ში (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
უჯრედები, რომლებიც სტაბილურად გამოხატავენ შერწყმული miniSOG გენს, მოთავსდნენ 6 სმ ჭურჭელში.~80% შერწყმის მიღწევის შემდეგ, უჯრედები ერთხელ გაირეცხა HBSS-ით (Gibco, #14025092), შემდეგ ინკუბირებული იქნა ქიმიური ზონდებით HBSS-ში 1 საათის განმავლობაში 37°C-ზე და განათდა ლურჯი შუქით.10 W LED 20 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.იმის დასადგენად, თუ რომელი ტიპის რეაქტიული ჟანგბადის სახეობაა ჩართული PDPL-ში, 0,5 მმ ვიტამინი C (MCE, #HY-B0166), 5 მმ ტროლოქსი (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), უჯრედებს დანამატების სახით დაემატა 100 მმ მანიტოლი (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 მმ NaN3.ცივი PBS-ით გარეცხვის შემდეგ, უჯრედები გაიხეხეს, შეაგროვეს 1,5 მლ ცენტრიფუგა მილებში და სონიკირდნენ წვერით 1 წუთის განმავლობაში 200 μl PBS-ში 1x პროტეაზას ინჰიბიტორით EDTA-ს გარეშე (1 წმ და 1 წმ გარეშე, ამპლიტუდა 35%).მიღებული ნარევი ცენტრიფუგირებული იყო 15,871 × გ 10 წუთის განმავლობაში 4 °C-ზე და ზენატანის კონცენტრაცია დარეგულირდა 1 მგ/მლ-მდე BCA ცილის საანალიზო ნაკრების გამოყენებით.ზემოაღნიშნული ლიზატის დაახლოებით 50 მკლ ინკუბირებული იყო 0.1 მმ როდამინ აზიდით (Aladdin, no. T131368), 1 მმ TCEP, 0.1 მმ TBTA ლიგანდი და 1 მმ CuSO4 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე ქვემოდან ზემოდან ბრუნვით.დაწკაპუნების რეაქციის შემდეგ, აცეტონით დალექვა განხორციელდა ნიმუშებში 250 მკლ წინასწარ გაცივებული აცეტონის დამატებით, ინკუბაციით -20°C-ზე 20 წუთის განმავლობაში და ცენტრიფუგა 6010×g-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე.შეაგროვეთ მარცვლები და ადუღეთ 50 μl 1x Laemmli-ის ბუფერში 10 წუთის განმავლობაში 95 °C-ზე.შემდეგ ნიმუშები გაანალიზდა SDS-PAGE გრძელ გელებზე და ვიზუალიზაცია მოხდა Bio-rad ChemiDoc MP Touch ვიზუალიზაციის სისტემის გამოყენებით Image Lab Touch პროგრამული უზრუნველყოფით.
რეკომბინანტული miniSOG-6xHis პროტეინის გამოხატვა და გაწმენდა განხორციელდა, როგორც ადრე იყო აღწერილი.მოკლედ, E. coli BL21(DE3) უჯრედები (TransGen, #CD701-02) გარდაიქმნა pET21a-miniSOG-6xHis-ით და პროტეინის ექსპრესია ინდუცირებული იყო 0.5 მმ IPTG-ით (Sangon, #A600168).უჯრედის ლიზისის შემდეგ, ცილები გაიწმინდა Ni-NTA აგაროზის მარცვლების გამოყენებით (MCE, no. 70666), დიალიზებული იქნა PBS-ის წინააღმდეგ და ინახება -80°C-ზე.
ანტისხეულებზე დაფუძნებული in vitro ეტიკეტის სიახლოვის ანალიზისთვის, შეურიეთ 100 μM გაწმენდილი miniSOG, 1 მმ ზონდი 3 და 1 მკგ ანტი-ეტიკეტის თაგვის მონოკლონური ანტისხეული (TransGen, #HT501-01) PBS-ში რეაქციის საერთო მოცულობამდე 50 μl..რეაქციის ნარევი დასხივებული იყო ლურჯი LED შუქით 0, 2, 5, 10 და 20 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.ნარევი ინკუბირებული იყო 0,1 მმ ბიოტინ-PEG3-აზიდით (Aladdin, #B122225), 1 მმ TCEP, 0,1 მმ TBTA ლიგანდით და 1 მმ CuSO4 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე ზევით მოძრაობის შეკერზე.მყისიერი რეაქციის შემდეგ, დაუმატეთ 4x Laemmli-ის ბუფერი პირდაპირ ნარევს და ადუღეთ 95°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში.ნიმუშები გაანალიზდა SDS-PAGE გელებზე და გაანალიზდა ვესტერნი ბლოტით სტრეპტავიდინ-HRP-ით (1:1000, Solarbio, #SE068).
ჰისტიდინის შემცველი სინთეზური პეპტიდი C-ტერმინალური ამიდაციით (LHDALDAK-CONH2) გამოიყენებოდა ახლომდებარე პეპტიდზე დაფუძნებული in vitro მარკირების გასაანალიზებლად.ამ ანალიზში, 100 μM გაწმენდილი miniSOG, 10 მმ ზონდი 3 და 2 მკგ/მლ სინთეზური პეპტიდი შერეული იყო PBS-ში რეაქციის საერთო მოცულობით 50 μl.რეაქციის ნარევი დასხივებული იყო ლურჯი LED შუქით 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.ნიმუშის ერთი მიკროლიტრი გაანალიზდა LC-MS სისტემის გამოყენებით (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight მასობრივი სპექტრომეტრი MassLynx სპექტრის ანალიზის პროგრამული უზრუნველყოფით).
HEK293T უჯრედები, რომლებიც სტაბილურად გამოხატავენ miniSOG შერწყმის გენს, დათესეს 10 სმ ჭურჭელში ორგანელების სხვადასხვა ლოკალიზაციის მქონე ხაზებისთვის (Mito, ER, Nucleus) და 15 სმ ჭურჭელში Parkin-miniSOG და BRD4-miniSOG ხაზებისთვის.~90% შერწყმის მიღწევის შემდეგ, უჯრედები ერთხელ გაირეცხა HBSS-ით, შემდეგ ინკუბირებული იყო ზონდით 3 HBSS-ში 1 საათის განმავლობაში 37°C-ზე და განათდა 10 ვტ ლურჯი LED-ით ოთახის ტემპერატურაზე.პარკინის უკონტაქტო მარკირებისთვის, 10 μM პროტონ კარბონილ ციანიდის მატარებელი m-ქლოროფენილჰიდრაზონი CCCP (Solarbio, #C6700) ზონდთან 3 HBSS-ში დაემატა 1 საათის განმავლობაში 37°C-ზე.უჯრედის ლიზის, დაწკაპუნების ქიმიის, რედუქციის და ალკილაციის საფეხურები იგივე იყო, რაც ზემოთ იყო აღწერილი, გარდა იმისა, რომ დაემატა 2 მგ ლიზატი და ბიოტინ PEG3 აზიდი გამოყენებული იქნა დაწკაპუნების რეაქციაში ფოტოდეგრადირებადი ბიოტინ აზიდის ნაცვლად.გამდიდრების შემდეგ, მარცვლები გარეცხილი იქნა 3-ჯერ 5 მლ PBS-ით, რომელიც შეიცავს 0.2% SDS-ს, 3-ჯერ 5 მლ PBS-ით, რომელიც შეიცავს 1 M შარდოვანას და 3-ჯერ 5 მლ PBS-ით.ამის შემდეგ, 2 მკგ ტრიფსინი დაემატა 300 μl 25 მმ ABC-ს, რომელიც შეიცავს 1 მ შარდოვანას, რათა ცილა გამოეყო ღამით 37°C ტემპერატურაზე.რეაქცია შეჩერდა ჭიანჭველა მჟავის დამატებით, სანამ არ მიიღწევა pH 2-3.მარცვლებზე ტრიფსინიზაციის შემდეგ, პეპტიდის ხსნარი დემარილდა SOLAµ HRP სვეტის (თერმო, #60209-001) გამოყენებით და გამხმარი Speedvac ვაკუუმ კონცენტრატორში.პეპტიდები ხელახლა იხსნება 0,1% ჭიანჭველა მჟავაში და 500 ნგ პეპტიდები გაანალიზებულია Orbitrap Fusion Lumos Tribrid მასობრივი სპექტრომეტრის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილია ზემოთ აღწერილი ნანო-ESI წყაროთი.პეპტიდები გამოყოფილი იყო კომერციულ RP-HPLC პრესვეტებზე (75 μm x 2 სმ) (თერმო, no. 164946) და ანალიტიკურ RP-HPLC სვეტებზე (75 μm x 25 სმ) (თერმო, no. 164941), ორივე სავსე 2 μm.გრადიენტი 8%-დან 35%-მდე ACN-მდე 60 წუთში, შემდეგ ხაზობრივად გაიზარდა 98%-მდე B-მდე 6 წუთში 300 ნლ/წთ სიჩქარით.MS სპექტრები (350-1500 მ/ზ) შეგროვდა 60000 გარჩევადობით, AGC 4 × 105 და მაქსიმალური შეყვანის დრო 50 ms.შერჩეული იონები თანმიმდევრულად დაიშალა HCD-ით 3 წმ ციკლში ნორმალიზებული შეჯახების ენერგიით 30%, ოთხპოლუსიანი იზოლაციის ფანჯარა 1.6 მ/ზ და გარჩევადობა 15000. 5 × 104 ტანდემი მასობრივი სპექტრომეტრი AGC სამიზნე და მაქსიმალური ინექციის დრო გამოყენებული იქნა 22 ms.დინამიური გამორიცხვა დაყენებულია 45 წამზე. გამოუყენებელი იონები ან 1+ და >7+ მუხტი იყო უარყოფილი MS/MS-ისთვის. გამოუყენებელი იონები ან 1+ და >7+ მუხტი იყო უარყოფილი MS/MS-ისთვის. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ და >7+ были отклонены для МС/МС. გამოუყენებელი იონები ან იონები მუხტით 1+ და >7+ იყო უარყოფილი MS/MS-ისთვის.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. დაუზუსტებელი იონები ან იონები მუხტით 1+ და >7+ იყო უარყოფილი MS/MS-ისთვის.
ნიმუშის მომზადების საფეხურები ნეიტრაავიდინის მარცვლების გამდიდრებამდე იგივე იყო, რაც ზემოთ აღწერილი LC-MS/MS ანალიზში.დაახლოებით 50 მკგ ლიზატი გამოიყენებოდა ჩატვირთვის კონტროლისთვის და 2 მგ ლიზატი გამოყენებული იყო დაწკაპუნების რეაქციებისთვის.ნეიტრავიდინით გამდიდრებისა და გარეცხვის შემდეგ, შეკრული ცილები გამოირეცხებოდა 50 მკლ Laemmli-ის ბუფერის დამატებით აგაროზის ფისის მარცვლებში და ადუღდება 95°C-ზე 5 წუთის განმავლობაში.საკონტროლო დატვირთვის შეყვანა და მარცვლებით გამდიდრებული ნიმუშები გაანალიზდა SDS-PAGE-ით და გადატანილი იყო PVDF მემბრანებზე (Milipore, #ISEQ00010) სტანდარტული Western blot მეთოდებით.მემბრანები დაიბლოკა 5% უცხიმო რძით (Sangon, #A600669) TBS-ში, რომელიც შეიცავს 0.1% tween-20 (TBST) და ინკუბირებული იყო თანმიმდევრულად პირველადი და მეორადი ანტისხეულებით.პირველადი ანტისხეულები განზავებული იყო 1:1000 5% უცხიმო რძეში TBST-ში და ინკუბირებული იყო ღამით 4°C-ზე.მეორადი ანტისხეულები გამოიყენებოდა 1:5000 თანაფარდობით და ინკუბირებული იყო 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.მემბრანების ვიზუალიზაცია მოხდა ქიმილუმინესცენციით Chemidoc MP გამოსახულების სისტემის გამოყენებით.ნახატზე გამოსახული ლაქების და გელების ყველა დაუმუშავებელი სკანირება წარმოდგენილია როგორც ნედლეული მონაცემები.
ამ კვლევაში გამოყენებული პირველადი ანტისხეულები მოიცავდა კურდღლის ანტი-SFPQ მონოკლონურ ანტისხეულს (CST, No. 71992), კურდღლის ანტი-FUS მონოკლონურ ანტისხეულს (CST, no. 67840), კურდღლის ანტი-NSUN2 პოლიკლონურ ანტისხეულს (Proteintech, no. 20854-1- AP), კურდღლის ანტი-mSin3A პოლიკლონური ანტისხეული (Abcam, #ab3479), თაგვის საწინააღმდეგო მონოკლონური ანტისხეული (TransGen, #HT201-02), თაგვის ანტი-β-აქტინის მონოკლონური ანტისხეული (TransGen, #HC201-01), კურდღლის ანტი -CDK2 მონოკლონური ანტისხეული (ABclonal, #A0094), კურდღლის მონოკლონური ანტისხეული CTBP1-ის მიმართ (ABclonal, #A11600), კურდღლის პოლიკლონალური ანტისხეული DUT-ზე (ABclonal, #A2901), კურდღლის პოლიკლონალური ანტისხეული PSMC4-ის მიმართ (ABclonal, #A2505), DNAJB1 პოლიკლონური ანტისხეული (ABclonal, # A5504).ეს ანტისხეულები გამოიყენებოდა 1:1000 განზავებით 5% უცხიმო რძეში TBST-ში.ამ კვლევაში გამოყენებული მეორადი ანტისხეულები მოიცავდა კურდღლის საწინააღმდეგო IgG (TransGen, #HS101-01), თაგვის საწინააღმდეგო IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 განზავებით.
შემდგომი გამოსაკვლევად, ურთიერთქმედებს თუ არა BRD4 SFPQ-თან, სტაბილური HEK293T და BRD4-miniSOG უჯრედები, რომლებიც ზედმეტად გამოხატავს HEK293T-ს, მოთავსებული იქნა 10 სმ ჭურჭელში.უჯრედები გარეცხილი იქნა ცივი PBS-ით და დალიეს 1 მლ Pierce IP ლიზის ბუფერში (თერმო ფიშერი, #87787) EDTA-უფრო პროტეაზას ინჰიბიტორით 30 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე.ამის შემდეგ, ლიზატები შეგროვდა 1,5 მლ ცენტრიფუგის მილებში და ცენტრიფუგირებულ იქნა 15871 xg 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე.ზენატანი შეგროვდა და ინკუბირებული იყო 5 მკგ ანტი-V5 ეტიკეტირებული თაგვის მონოკლონური ანტისხეულით (CST, #80076) ღამით 4°C-ზე.გარეცხეთ დაახლოებით 50 μl პროტეინის A/G მაგნიტური მძივები (MCE, #HY-K0202) ორჯერ PBS-ით, რომელიც შეიცავს 0.5% Tween-20-ს.შემდეგ უჯრედის ლიზატები ინკუბირებული იყო მაგნიტური მარცვლებით 4 საათის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე ქვემოდან ზევით ბრუნვით.შემდეგ მძივები ოთხჯერ გარეცხეს 1 მლ PBST ბუფერით და ადუღეს 95°C-ზე 5 წუთის განმავლობაში.ნიმუშები გაანალიზდა SDS-PAGE გელებზე და გადაიტანეს PVDF მემბრანებზე სტანდარტული Western blot მეთოდების გამოყენებით.მემბრანები დაიბლოკა 5% უცხიმო რძეში TBST-ში და ინკუბირებული იყო თანმიმდევრულად პირველადი და მეორადი ანტისხეულებით.პირველადი ანტისხეული კურდღლის ანტი-SFPQ მონოკლონური ანტისხეული (CST, #71992) გამოიყენებოდა 1:1000 თანაფარდობით 5% უცხიმო რძეში TBST-ში და ინკუბირებული იყო ღამით 4°C-ზე.კურდღლის საწინააღმდეგო IgG გამოიყენებოდა 1:5000 თანაფარდობით და ინკუბირებული იყო 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.მემბრანების ვიზუალიზაცია მოხდა ქიმილუმინესცენციით Chemidoc MP გამოსახულების სისტემის გამოყენებით.
ყველა სტრუქტურა, რომელიც გამოიყენება გამხსნელზე ხელმისაწვდომ ზედაპირულ ფართობზე (SASA) ანალიზისთვის, მიღებული იყო პროტეინის მონაცემთა ბანკიდან (PDB)52 ან AlphaFold პროტეინის სტრუქტურის მონაცემთა ბაზიდან53.აბსოლუტური SASA გამოითვლებოდა თითოეული ნარჩენისთვის FreeSASA პროგრამის გამოყენებით.მხოლოდ სრული და ცალსახა SASA მონაცემები ეტიკეტირებული ჰისტიდინისთვის და მისი მეზობლებისთვის გამოყენებული იყო თითოეული სტრუქტურისთვის საშუალო SASA-ს მისაღებად.გამხსნელის ფარდობითი ხელმისაწვდომობა (RSA) თითოეული ჰისტიდინისთვის გამოითვლებოდა SASA აბსოლუტური მნიშვნელობის გაყოფით გამხსნელისთვის ხელმისაწვდომ ნარჩენი ზედაპირის ემპირიულ მაქსიმალურ შესაძლო ფართობზე.შემდეგ ყველა ჰისტიდინი კლასიფიცირდება როგორც ფარული, თუ საშუალო RSA იყო 20%-ზე დაბალი, წინააღმდეგ შემთხვევაში გამოვლენილი იყო56.
DDA რეჟიმში მიღებული Raw ფაილები მოძებნილი იქნა Proteome Discoverer (v2.5) ან MSfragger (Fragpipe v15.0) გამოყენებით SwissProt-ის დამოწმებულ პროტეინის შესაბამის მონაცემთა ბაზაში, რომელიც შეიცავს საერთო დამაბინძურებლებს.პეპტიდებს ესაჭიროებოდათ სრული ტრიპსინი ორი გამოტოვებული გაყოფის ადგილით, კარბამოილის მეთილაცია, როგორც ფიქსირებული მოდიფიკაცია და მეთიონინის დაჟანგვა, როგორც დინამიური მოდიფიკაცია.წინამორბედისა და ფრაგმენტის წონის ტოლერანტობა დაყენებული იყო 10 ppm და 0.02 Da (MS2 Orbitrap), შესაბამისად. დამაბინძურებლების დარტყმები ამოიღეს და ცილები გაფილტრული იქნა ცრუ აღმოჩენის მაჩვენებლის მისაღებად <1%. დამაბინძურებლების დარტყმები ამოიღეს და ცილები გაფილტრული იქნა ცრუ აღმოჩენის მაჩვენებლის მისაღებად <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. დამაბინძურებლების დარტყმები ამოღებულ იქნა და ცილები გაფილტრული იყო, რათა მცდარი გამოვლენის მაჩვენებელი <1% იყო.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. დამაბინძურებლების ჰიტები ამოღებულ იქნა და ცილები გაფილტრული იქნა ცრუ დადებითი მაჩვენებლის მისაღწევად <1%.რაოდენობრივი ანალიზისთვის ეტიკეტების გამოყენების გარეშე გამოყენებული იქნა ცილის ნორმალიზებული შემცველობა სამი ბიოლოგიური გამეორებიდან.ცილის სუბუჯრედული ლოკალიზაციის ანალიზი ჩატარდა გენის ონტოლოგიის (GO) ანალიზის გამოყენებით DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 და მონაცემთა ბაზებიდან, რომელიც შედგენილი და გამოქვეყნებულია Alice Ting ჯგუფის მიერ.ვულკანის რუკა მიღებულია პერსევსისგან (v1.6.15.0). პროტეინის სიმრავლის ჯერადობის ცვლილებები შემოწმდა სტატისტიკური მნიშვნელოვნებისთვის ორმხრივი t-ტესტის გამოყენებით და პროტეინის ჰიტები იდენტიფიცირებული იყო სიმრავლის ცვლილებით >2 (თუ სხვაგვარად არ არის მითითებული) და p მნიშვნელობა <0.05. პროტეინის სიმრავლის ჯერადობის ცვლილებები შემოწმდა სტატისტიკური მნიშვნელოვნებისთვის ორმხრივი t-ტესტის გამოყენებით და პროტეინის ჰიტები იდენტიფიცირებული იყო სიმრავლის ცვლილებით >2 (თუ სხვაგვარად არ არის მითითებული) და p მნიშვნელობა <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость со использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы изменением содержания> 2 (если не 5, значение) პროტეინის შემცველობის ნაკეცების ცვლილებები ტესტირებულ იქნა სტატისტიკური მნიშვნელოვნებისთვის ორმხრივი t-ტესტის გამოყენებით და პროტეინის შესატყვისი გამოვლინდა შინაარსის ცვლილების >2 (თუ სხვა რამ არ არის აღნიშნული) და ap მნიშვნელობა <0.05.TT Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли со использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) <0, знач. ცილის შემცველობის ნაკეცების ცვლილებების სტატისტიკური მნიშვნელოვნება შემოწმდა ორმხრივი t-ტესტის გამოყენებით და პროტეინის შესატყვისები განისაზღვრა შინაარსის ცვლილებებისთვის >2 (თუ სხვაგვარად არ არის მითითებული) და p-მნიშვნელობებისთვის <0,05.პროტეინის ურთიერთქმედების ანალიზი ჩატარდა GO ანალიზის გამოყენებით String მონაცემთა ბაზასთან ერთად.
მსგავსი შედეგებით განხორციელდა სამი ბიოლოგიური გამეორება.სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა GraphPad Prism-ით (GraphPad პროგრამული უზრუნველყოფა) და ვულკანის ნაკვეთები გენერირებული იყო Perseus-ით (v1.6.15.0).ორი ჯგუფის შესადარებლად, p-მნიშვნელობები განისაზღვრა ორმხრივი სტუდენტური t-ტესტის გამოყენებით.მხოლოდ ექსპერიმენტულ ჯგუფში ორჯერ იდენტიფიცირებული მხოლოდ ერთი ცილა იყო ჩართული ვულკანის ნაკვეთებში, ხოლო საკონტროლო ჯგუფში შესაბამისი გამოტოვებული მნიშვნელობები შეიცვალა პერსევსით ნორმალური განაწილებიდან, რათა შესაძლებელი ყოფილიყო p-მნიშვნელობის გამოთვლა.შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.სტატისტიკური ანალიზისთვის პროტეომიურ ანალიზებში შენარჩუნდა ცილების სიმრავლე, რომლებიც სულ მცირე ორ ბიოლოგიურ რეპლიკაში ჩანდა.სტატისტიკური მეთოდები არ იყო გამოყენებული ნიმუშის ზომის წინასწარ განსაზღვრისათვის.ექსპერიმენტები შემთხვევითი არ არის.ექსპერიმენტისა და შედეგების შეფასებისას მკვლევარები ბრმა არ იყვნენ ამოცანების მიმართ.
კვლევის დიზაინის შესახებ დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ ბუნების კვლევის ანგარიშის აბსტრაქტი, რომელიც დაკავშირებულია ამ სტატიასთან.
ამ კვლევაში მიღებული მასის სპექტრომეტრიის მონაცემები გადაეგზავნა ProteomeXchange კონსორციუმს iProX57 პარტნიორი საცავის მეშვეობით მონაცემთა ნაკრების ID PXD034811 (PDPL-MS მონაცემთა ბაზაში).ნედლეული მონაცემები მოწოდებულია ნედლეული მონაცემთა ფაილების სახით.ამ სტატიაში მოცემულია ორიგინალური მონაცემები.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. სამეზობლოს გაცნობა: სიახლოვეზე დამოკიდებული ბიოტინილაციის გამოყენება ცილოვანი კომპლექსების დასახასიათებლად და ორგანელების რუკაზე. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. სამეზობლოს გაცნობა: სიახლოვეზე დამოკიდებული ბიოტინილაციის გამოყენება ცილოვანი კომპლექსების დასახასიათებლად და ორგანელების რუკაზე.Gingras, AS, Abe, KT და Raut, B. გარემოს გაცნობა: სიახლოვეზე დამოკიდებული ბიოტინილაციის გამოყენება ცილოვანი კომპლექსების დასახასიათებლად და ორგანელების რუკაზე. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. მეზობლობის გაგება: გამოიყენეთ უბნის დამოკიდებულება ბიოლოგიურ სიცოცხლეზე.Gingras, AS, Abe, KT და Raut, B. სიახლოვის გაგება: ცილოვანი კომპლექსების დახასიათება და ორგანელების რუკების შედგენა სიახლოვეზე დამოკიდებული ბიოტინილაციის გამოყენებით.მიმდინარე.Ჩემი აზრი.ქიმიური.ბიოლოგია 48, 44–54 (2019).
გერი, ჯ.ბ. და სხვ.მიკროგარემოს რუკა დექსტერის ენერგიის იმუნურ უჯრედებზე გადაცემით.Science 367, 1091–1097 (2020).
ჰერტლინგი, EL და სხვ.ორი პროტეომის მასშტაბის ქსელები აღმოაჩენენ ადამიანის ინტერაქტომის უჯრედის სპეციფიკურ რემოდელირებას.უჯრედები 184, 3022–3040.e3028 (2021).