სიახლეები

ინფექციური დაავადებების გამოვლენის ტრადიციული სადიაგნოსტიკო სტრატეგიები მოითხოვს სტაციონარული ინსტრუმენტების გამოყენებას, რომლებიც არ არის შესაფერისი მოვლის წერტილის ტესტირებისთვის (POCT).Emerging microfluidics არის უაღრესად მინიატურული, ავტომატიზირებული და ინტეგრირებული ტექნოლოგია, რომელიც პოტენციური ალტერნატივაა ტრადიციული მეთოდებისთვის სწრაფი, იაფი, ზუსტი ადგილზე დიაგნოსტიკისთვის.მოლეკულური დიაგნოსტიკის მეთოდები ფართოდ გამოიყენება მიკროფლიდური მოწყობილობებში, როგორც პათოგენების გამოვლენის ყველაზე ეფექტური მეთოდები.ეს მიმოხილვა აჯამებს ბოლოდროინდელ მიღწევებს ინფექციური დაავადებების მიკროფლიდიზე დაფუძნებულ მოლეკულურ დიაგნოსტიკაში, როგორც აკადემიური, ასევე ინდუსტრიული პერსპექტივიდან.პირველ რიგში, ჩვენ აღვწერთ ნუკლეინის მჟავების ტიპურ ჩიპზე დამუშავებას, ნიმუშების წინასწარ დამუშავების, გაძლიერების და სიგნალის წაკითხვის ჩათვლით.შემდეგ შედარებულია ოთხი ტიპის მიკროფლუიდური პლატფორმის მახასიათებლები, უპირატესობები და უარყოფითი მხარეები.შემდეგი, ჩვენ განვიხილავთ ციფრული ანალიზის გამოყენებას ნუკლეინის მჟავების აბსოლუტური რაოდენობებისთვის.როგორც კლასიკური, ასევე უახლესი კომერციული მიკროსთხევადზე დაფუძნებული მოლეკულური დიაგნოსტიკური მოწყობილობები შეჯამებულია, როგორც ბაზრის ამჟამინდელი მდგომარეობის მტკიცებულება.და ბოლოს, შემოგთავაზებთ ინფექციური დაავადებების მიკროფლუიდური დიაგნოსტიკის სამომავლო მიმართულებებს.
ინფექციურ დაავადებებს იწვევს პათოგენები, მათ შორის ბაქტერიები, ვირუსები და პარაზიტები, რომლებიც გავრცელებულია მთელ მსოფლიოში.სხვა დაავადებებისგან განსხვავებით, პათოგენები სწრაფად ინფიცირდებიან და ვრცელდება ადამიანებსა და მასპინძელ ცხოველებს შორის ინოკულაციის, ჰაერისა და წყლის საშუალებით [1].ინფექციური დაავადებების პრევენცია გადამწყვეტია, როგორც საზოგადოებრივი ჯანმრთელობის ღონისძიება.ინფექციურ დაავადებებთან ბრძოლის სამი ძირითადი სტრატეგია: (1) ინფექციის წყაროს კონტროლი;(2) გადაცემის გზის შეწყვეტა;(3) მგრძნობიარე პოპულაციების დაცვა.მთავარ სტრატეგიებს შორის ყველაზე მნიშვნელოვან სტრატეგიად ითვლება ინფექციის წყაროს კონტროლი მისი მოხერხებულობისა და დაბალი ღირებულების გამო.ინფიცირებული პირების სწრაფი დიაგნოზი, იზოლაცია და მკურნალობა კრიტიკულია, რაც მოითხოვს სწრაფ, მგრძნობიარე და ზუსტ დიაგნოსტიკურ სტრატეგიებს [2].ინფექციური დაავადებების ამჟამინდელი დიაგნოზი ჩვეულებრივ აერთიანებს კლინიკურ გამოკვლევას, რომელიც დაფუძნებულია ნიშნებსა და სიმპტომებზე და ლაბორატორიულ კვლევებზე, როგორიცაა უჯრედის კულტურა და მოლეკულური დიაგნოსტიკა, რომელიც მოითხოვს გაწვრთნილ პერსონალს, შრომის ინტენსიურ პროცედურებს და ძვირადღირებულ სატესტო აღჭურვილობას [3, 4].ინფექციური დაავადებების გავრცელების პრევენცია მოითხოვს სწრაფ, იაფ და ზუსტ ლოკალურ დიაგნოზს, განსაკუთრებით რესურსებით შეზღუდულ ადგილებში, სადაც ინფექციური დაავადებები ხშირი და მძიმეა [5], ასევე მკურნალობა უდაბნოში ან ბრძოლის ველზე, სადაც საგანგებო სიტუაციები არაპროგნოზირებადია..სამედიცინო დახმარება შეზღუდულია [6].ამ კონტექსტში, მიკროფლუიდიკა არის ტექნოლოგია, რომელიც აერთიანებს მიკროელექტრომექანიკური სისტემების ტექნოლოგიებს, ნანოტექნოლოგიას ან მასალების მეცნიერებას სითხის ზუსტი მანიპულირებისთვის [7,8,9,10], რაც უზრუნველყოფს ახალ შესაძლებლობებს მოვლის წერტილის გამოვლენისთვის (POCT).) ინფექციური აგენტები საავადმყოფოებისა და ლაბორატორიების გარეთ.ტრადიციულ შრომატევად დიაგნოსტიკასთან შედარებით, მიკროფლუიდური ტექნოლოგია გთავაზობთ ნიმუშებისა და ხარჯების დაზოგვას მოლეკულური დიაგნოსტიკისთვის დაავადების გავრცელების დროს.კორონავირუსული დაავადების გლობალური გავრცელება 2019 (COVID-19) გამოწვეულია მძიმე მწვავე რესპირატორული სინდრომით, კორონავირუსი 2 (SARS-CoV-2), ამიტომ მიკროფლუიდების მნიშვნელობა პანდემიის დროული პრევენციისა და კონტროლისთვის კვლავ ხაზგასმულია [11, 12 , 13].ტრადიციული დიაგნოსტიკისგან განსხვავებით, მიკროფლუიდური POCT იყენებს მცირე პორტატულ მოწყობილობებს, დაწყებული სკამების ანალიზატორებიდან დაწყებული მცირე გვერდითი ტესტის ზოლებით სინჯის აღების წერტილთან ახლოს შესამოწმებლად [14].ეს ტესტები ახასიათებს ნიმუშის გამარტივებულ ან საერთოდ არ მომზადებას, სიგნალის სწრაფ გაძლიერებას და მგრძნობიარე სიგნალის კითხვას, რაც იწვევს მოკლე ხანგრძლივობას და ზუსტ შედეგებს წუთებში.მიკროსთხევადზე დაფუძნებული ჯანდაცვის ინსტრუმენტების ხელმისაწვდომობამ და მასობრივმა წარმოებამ გააფართოვა მათი ხარჯთეფექტური და პირდაპირი დიაგნოსტიკური აპლიკაციები საავადმყოფოს გარეთ, პაციენტთან ახლოს და სახლშიც კი.
ინფექციური დაავადებების დიაგნოსტიკის არსებულ სტრატეგიებს შორის მოლეკულური დიაგნოსტიკა ერთ-ერთი ყველაზე მგრძნობიარეა [15, 16].გარდა ამისა, მოლეკულური დიაგნოსტიკა ხშირად გამოიყენება, როგორც ოქროს სტანდარტი COVID-19-ის უწყვეტი გამოვლენისთვის, რაც საშუალებას იძლევა რნმ-ის ან დნმ-ის ვირუსის სპეციფიკური რეგიონების პირდაპირი გამოვლენა იმუნური პასუხის დაწყებამდე [17, 18].მიმდინარე მიმოხილვაში ჩვენ წარმოგიდგენთ უახლეს მიღწევებს მიკროფლიდიებზე დაფუძნებული მოლეკულური დიაგნოსტიკური პროცესების ინფექციური დაავადებებისათვის, აკადემიური პერსპექტივიდან სამომავლო ინდუსტრიულ პერსპექტივამდე (ნახ. 1).ჩვენ დავიწყებთ ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის სამი ძირითადი ნაბიჯით: ჩიპზე ნიმუშის წინასწარი დამუშავება, ნუკლეინის მჟავის გაძლიერება და სიგნალის კითხვა.შემდეგ ჩვენ შევადარეთ სხვადასხვა ტიპის მიკროსლუიდური პლატფორმები მათი სტრუქტურითა და ფუნქციით, აჩვენეთ უნიკალური მახასიათებლები (ძლიერი და სუსტი მხარეები).ციფრული ნუკლეინის მჟავის გამოვლენა შემდგომ განხილულია და მოცემულია მესამე თაობის ტექნოლოგიის მაგალითი ინფექციური პათოგენის მოლეკულების აბსოლუტური რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის.გარდა ამისა, წარმოდგენილი იქნება რამდენიმე ტიპიური და უახლესი კომერციული POCT მოწყობილობა მოლეკულური დიაგნოსტიკის მიკროფლუიდური POCT ბაზრის ამჟამინდელი მდგომარეობის დემონსტრირებისთვის.ჩვენ ასევე განვიხილავთ და ავხსნით ჩვენს ხედვას მომავალი აპლიკაციებისთვის.
ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის მიკროსლუიდური ჩიპების მოდულები შეიძლება დაიყოს სამ კატეგორიად (ნიმუშების აღება, ამოცნობა და სიგნალიზაცია) მათი ფუნქციების მიხედვით [19].ამ მოდულებს შორის სინჯის აღების მოდული ძირითადად ახორციელებს ნიმუშის ლიზისს და ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციას.სენსორის მოდული ძირითადად აკონტროლებს ნუკლეინის მჟავას სიგნალების გარდაქმნას და გაძლიერებას.სასიგნალო მოდული აღმოაჩენს სენსორული მოდულის მიერ გარდაქმნილ და დამუშავებულ სიგნალს.ჩიპზე ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის პროცესის საფუძველზე, ჩვენ შევაჯამებთ სხვადასხვა ჩიპებს, რომლებსაც შეუძლიათ შეასრულონ "შეყვანის და გამომავალი" ფუნქცია.
ნუკლეინის მჟავის გამოვლენის პირველი ნაბიჯი არის ნუკლეინის მჟავის ექსტრაქცია, ანუ სამიზნე ნუკლეინის მჟავის იზოლირება ორიგინალური ნიმუშიდან.ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქცია ხორციელდება ნუკლეინის მჟავების სხვა მოლეკულური დამაბინძურებლებისგან გასაწმენდად, ნუკლეინის მჟავას მოლეკულების პირველადი სტრუქტურის მთლიანობის უზრუნველსაყოფად და შედეგების ოპტიმიზაციის მიზნით.ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქცია მოითხოვს საჭირო ნიმუშის ლიზისს და ნუკლეინის მჟავას აღებას, რომლის ხარისხი და ეფექტურობა დიდ გავლენას ახდენს კვლევისა და დიაგნოსტიკური შედეგების შესახებ.ნებისმიერი დახვეწილი გვერდითი მოვლენა ექსტრაქციის დროს შეიძლება შეზღუდოს შემდგომი გამოვლენა.მაგალითად, პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) და მარყუჟის იზოთერმული გაძლიერების (LAMP) მეთოდები ინჰიბირებულია ზოგიერთი ნარჩენი ორგანული გამხსნელებით, როგორიცაა ეთანოლი და იზოპროპანოლი ნუკლეინის მჟავას იზოლაციის რეაგენტებში [20].თხევადი-თხევადი ექსტრაქცია და მყარი ფაზის ექსტრაქცია არის ნუკლეინის მჟავების იზოლირების ყველაზე პოპულარული მეთოდები [21], თუმცა, ჩიპზე თხევადი-თხევადი ექსტრაქცია უკიდურესად შეზღუდულია, რადგან თხევადი-თხევადი ექსტრაქციისას გამოყენებული რეაგენტები იწვევენ მიკროფლუიდური ჩიპების უმეტესობის კოროზიას. .აქ ჩვენ გამოვყოფთ მიკრომასივებზე დაფუძნებულ მყარი ფაზის მოპოვების მეთოდებს და შევადარებთ მათ უპირატესობებსა და ნაკლოვანებებს.
სილიციუმი არის ნუკლეინის მჟავებთან თავსებადი სუბსტრატის მასალა მისი ბიოთავსებადობის, სტაბილურობისა და მოდიფიკაციის სიმარტივის გამო [22].მნიშვნელოვანია, რომ როდესაც მოდიფიცირებულია სილიციუმის დიოქსიდის ან სხვა მასალებით, ეს კომპოზიტი ავლენს თვისებებს ადსორბირებას უარყოფითად დამუხტულ ნუკლეინის მჟავებს დაბალი pH-ის, მაღალი მარილის პირობებში, ხოლო გამორეცხვისას მაღალი pH, დაბალი მარილის ხსნარებით.ამ ფენომენის საფუძველზე შესაძლებელია ნუკლეინის მჟავის გაწმენდა.
სილიციუმზე დაფუძნებული მასალების სხვადასხვა ფორმა გამოიყენება ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციისთვის მიკროსთხევადებში, როგორიცაა სილიციუმის მძივები, ფხვნილები, მიკრობოჭკოვანი ფილტრები და სილიციუმის მემბრანები [23, 24, 25, 26].მასალის თვისებებიდან გამომდინარე, სილიკონზე დაფუძნებული მასალები შეიძლება გამოყენებულ იქნას მიკროსქემებში სხვადასხვა გზით.მაგალითად, სილიციუმის დიოქსიდის გრანულები, ფხვნილები და კომერციული ნანოფილტრები შეიძლება უბრალოდ განთავსდეს მიკროფლუიდური ჩიპების ფორებში ან მიკროარხებში და დაეხმარონ ნუკლეინის მჟავების ამოღებას ნიმუშებიდან [27, 28, 29].ზედაპირულად მოდიფიცირებული სილიციუმის მემბრანები ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას პათოგენებისგან დნმ-ის სწრაფად გასაწმენდად დაბალ ფასად.მაგალითად, Wang et al.[30] დენატურირებადი ამპლიფიკაციის რეაქციების ვეზიკულის შუამავლობით ჯაჭვის გაცვლასთან ერთად ქიტოზანის ოლიგოსაქარიდებით დაფარული სილიციუმის მემბრანების კომბინაციით, დაინერგა მრავალმხრივი პორტატული სისტემა, რომელმაც წარმატებით გამოავლინა 102-108 კოლონიის წარმომქმნელი ერთეული.(CFU)/მლ Vibrio parahaemolyticus.და ვირუსის არსებობა ადვილად შესამჩნევი იყო.პაუელი და სხვ.[31] სილიკონზე დაფუძნებული მიკრომასივები შემდეგ გამოიყენეს C ჰეპატიტის ვირუსის (HCV), ადამიანის იმუნოდეფიციტის ვირუსის (აივ), ზიკას ვირუსის და ადამიანის პაპილომავირუსის გამოსავლენად და ავტომატური გავრცელებისთვის, რომელშიც შეიქმნა 1.3 μl გრეხილი მიკრორეაქტორი რნმ ვირუსების დასაჭერად.და შეასრულეთ in situ გაძლიერება.ამ მეთოდების გარდა, ზედაპირულად მოდიფიცირებული სილიციუმის მიკროსვეტები ასევე მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციაში, რადგან მოდიფიცირებული მასალის გეომეტრია და თვისებები მნიშვნელოვნად ზრდის მოპოვების ეფექტურობას.ჩენი და სხვ.[32] შესთავაზა მიკროსთხევადი პლატფორმა დაბალი კონცენტრაციის რნმ-ის იზოლირებისთვის, რომელიც ეფუძნება ამინო დაფარული სილიციუმის მიკროსვეტებს.ეს მიკროსთხევადი მოწყობილობა აერთიანებს 0,25 სმ2 მიკროსპილენძის მასივს სილიკონის სუბსტრატზე, რათა მიაღწიოს მოპოვების უფრო მაღალ ეფექტურობას მაღალი ზედაპირის ფართობისა და მოცულობის შეფარდების დიზაინის წყალობით.ამ დიზაინის უპირატესობა ის არის, რომ მიკროსთხევად მოწყობილობას შეუძლია მიაღწიოს 95%-მდე ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციის ეფექტურობას.სილიკონზე დაფუძნებული ეს სტრატეგიები აჩვენებს ნუკლეინის მჟავების სწრაფად იზოლირების ღირებულებას დაბალ ფასად.მიკროსთხევად ჩიპებთან ერთად, სილიკონზე დაფუძნებული ექსტრაქციის სტრატეგიებს შეუძლიათ არა მხოლოდ გაზარდონ ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის ეფექტურობა, არამედ ხელი შეუწყონ ანალიტიკური მოწყობილობების მინიატურიზაციას და ინტეგრაციას [20].
მაგნიტური გამოყოფის მეთოდები იყენებენ მაგნიტურ ნაწილაკებს ნუკლეინის მჟავების იზოლირებისთვის გარე მაგნიტური ველის არსებობისას.ხშირად გამოყენებული მაგნიტური ნაწილაკები მოიცავს Fe3O4 ან γ-Fe2O3 მაგნიტურ ნაწილაკებს, რომლებიც დაფარულია სილიციუმით, ამინო და კარბოქსილით [33,34,35,36].მაგნიტური ნაწილაკების გამორჩეული თვისება სილიკონზე დაფუძნებულ SPE მეთოდებთან შედარებით არის მანიპულირებისა და კონტროლის სიმარტივე გარე მაგნიტებით.
ნუკლეინის მჟავებსა და სილიციუმს შორის ელექტროსტატიკური ურთიერთქმედების გამოყენებით, მარილის მაღალი და დაბალი pH-ის პირობებში, ნუკლეინის მჟავები შეიწოვება სილიციუმით დაფარული მაგნიტური ნაწილაკების ზედაპირზე, ხოლო დაბალი მარილისა და მაღალი pH-ის პირობებში მოლეკულების გარეცხვა შესაძლებელია. ისევ..სილიციუმით დაფარული მაგნიტური მძივები შესაძლებელს ხდის დნმ-ის ამოღებას დიდი მოცულობის ნიმუშებიდან (400 μL) მაგნიტურად კონტროლირებადი მოძრაობის გამოყენებით [37].როგორც დემონსტრაცია, როდრიგეს-მატეოსი და სხვ.[38] გამოიყენა რეგულირებადი მაგნიტები მაგნიტური მძივების გადაცემის გასაკონტროლებლად სხვადასხვა კამერებში.სილიციუმით დაფარული მაგნიტური ნაწილაკების საფუძველზე, SARS-CoV-2 გენომური რნმ-ის 470 ასლი/მლ შეიძლება ამოღებულ იქნეს ჩამდინარე წყლების ნიმუშებიდან LAMP უკუ ტრანსკრიფციის გამოვლენისთვის (RT-LAMP) და პასუხის წაკითხვა შესაძლებელია 1 საათის განმავლობაში.შეუიარაღებელი თვალი (ნახ. 2ა).
მოწყობილობები, რომლებიც დაფუძნებულია მაგნიტურ და ფოროვან მასალებზე.IFAST RT-LAMP მიკროფლუიდური მოწყობილობის კონცეპტუალური დიაგრამა SARS-CoV-2 რნმ-ის გამოვლენისთვის (ადაპტირებულია [38]-დან).b ცენტრიფუგა მიკრო მოწყობილობა dSPE ბუკალური ნაცხის ნუკლეინის მჟავისთვის (ადაპტირებულია [39]-დან).c ჩამონტაჟებული სინჯის კონცენტრატორი FTA® ბარათის გამოყენებით (ადაპტირებულია [50]-დან).d Fusion 5 ფილტრის ქაღალდი მოდიფიცირებული ჩიტოზანით (ადაპტირებულია [51]-დან).SARS-CoV-2 მძიმე მწვავე რესპირატორული სინდრომი კორონავირუსი 2, RT-LAMP საპირისპირო ტრანსკრიფციის მარყუჟის შუამავლობით გამოწვეული იზოთერმული გაძლიერება, FTA მპოვნელების ტექნოლოგიური პარტნიორები, NA ნუკლეინის მჟავა
დადებითად დამუხტული მაგნიტური ნაწილაკები იდეალურია ნუკლეინის მჟავის ფოსფატის ხერხემლის დასამაგრებლად.მარილის გარკვეული კონცენტრაციის დროს ნუკლეინის მჟავების უარყოფითად დამუხტული ფოსფატური ჯგუფები შეიძლება დადებითად იყოს დამუხტული მაგნიტური კომპოზიტური ნაწილაკების ზედაპირზე.ამიტომ, ნუკლეინის მჟავების ექსტრაქციისთვის შეიქმნა მაგნიტური ნანონაწილაკები უხეში ზედაპირით და ამინოჯგუფების მაღალი სიმკვრივით.მაგნიტური გამოყოფისა და დაბლოკვის შემდეგ, მაგნიტური ნანონაწილაკები და დნმ-ის კომპლექსები შეიძლება გამოყენებულ იქნას უშუალოდ PCR-ში, რაც გამორიცხავს რთული და შრომატევადი გაწმენდისა და გამორეცხვის ოპერაციების საჭიროებას [35].ნეგატიური კარბოქსილის ჯგუფებით დაფარული მაგნიტური ნანონაწილაკები ასევე გამოიყენება ზედაპირებზე ადსორბირებული ნუკლეინის მჟავების გამოსაყოფად მაღალი კონცენტრაციის პოლიეთილენ გლიკოლისა და ნატრიუმის ქლორიდის ხსნარებში [36].ამ ზედაპირით მოდიფიცირებული მაგნიტური მძივებით, დნმ-ის ექსტრაქცია თავსებადია შემდგომ გაძლიერებასთან.დიგნანი და სხვ.[39] აღწერილია ავტომატური და პორტატული ცენტრიფუგაული მიკროფლუიდური პლატფორმა ნუკლეინის მჟავით წინასწარი დამუშავებისთვის, რაც საშუალებას აძლევს არატექნიკურ პერსონალს გამოიყენოს იგი ადგილზე.გარდა ამისა, იზოლირებული დნმ-ის თავსებადობა LAMP-თან, მეთოდი, რომელიც კარგად არის მორგებული ნუკლეინის მჟავების ანალიზისთვის, შემდგომში ასახავს აღჭურვილობის მინიმალურ მოთხოვნებს და ვარგისიანობას კოლორიმეტრული ანალიზისთვის (ნახ. 2b).
მაგნიტური მარცვლების მეთოდები გვთავაზობს ავტომატური მოპოვების შესაძლებლობას, რომელთაგან ზოგიერთი არსებობს კომერციულ ავტომატურ ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქტორებში [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (პეკინი, ჩინეთი) და Biomek®;ბეკმანი (მაიამი, აშშ).), ფლორიდა, აშშ)].მაგნიტური მარცვლების მიკროფლუიდების კომბინირების უპირატესობები შეიძლება გამოყენებულ იქნას ნუკლეინის მჟავების ეფექტური ავტომატური მოპოვებისთვის, რაც პოტენციურად ხელს შეუწყობს მოლეკულური დიაგნოსტიკის განვითარებას;თუმცა, მაგნიტური მარცვლების კომბინაცია მიკროფლუიდიკასთან კვლავ დიდწილად ეყრდნობა კომპლექსურ საკონტროლო სისტემებს მაგნიტური მარცვლების ზუსტი მანიპულირებისთვის, რაც განმარტავს კომერციული პროდუქტების მოცულობით და ძვირადღირებულ პოპულარობას, რაც ზღუდავს მაგნიტური მძივების შემდგომ გამოყენებას POCT-ში.
რამდენიმე ფოროვანი მასალა, როგორიცაა მოდიფიცირებული ნიტროცელულოზის ფილტრები, Finders Technology Associates (FTA) ბარათები, პოლიეთერსულფონზე დაფუძნებული ფილტრის ქაღალდები და გლიკანით დაფარული მასალები ასევე გამოყენებულია ნუკლეინის მჟავების გამოვლენისთვის [40, 41, 42, 43, 44].ფოროვანი ბოჭკოვანი მასალები, როგორიცაა ბოჭკოვანი ქაღალდი, პირველად გამოიყენეს დნმ-ის იზოლირებისთვის გრძელჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულების ბოჭკოებთან ფიზიკურად ჩახლართვით.მცირე ფორები იწვევს დნმ-ის მოლეკულების ძლიერ ფიზიკურ შეზღუდვას, რაც დადებითად მოქმედებს დნმ-ის ექსტრაქციაზე.ბოჭკოვანი ქაღალდის ფორების სხვადასხვა ზომის გამო, ექსტრაქციის ეფექტურობა ვერ აკმაყოფილებს დნმ-ის გაძლიერების საჭიროებებს [45, 46].FTA ბარათი არის კომერციული ფილტრის ქაღალდი, რომელიც გამოიყენება სასამართლო მედიცინის სფეროში და ფართოდ გამოიყენება მოლეკულური დიაგნოსტიკის სხვა სფეროებში.სხვადასხვა ქიმიკატებით გაჟღენთილი ცელულოზის ფილტრის ქაღალდის გამოყენებით ნიმუშში უჯრედული მემბრანების ლიზისთვის, გამოთავისუფლებული დნმ დაცულია დეგრადაციისგან 2 წლამდე.ცოტა ხნის წინ, გაჟღენთილი ცელულოზის ქაღალდი შეიქმნა სხვადასხვა პათოგენების მოლეკულური გამოვლენისთვის, მათ შორის SARS-CoV-2, ლეიშმანიოზი და მალარია [47,48,49].იზოლირებულ პლაზმაში აივ იზოლირებულია უშუალოდ და ვირუსული ნუკლეინის მჟავა გამდიდრებულია კონცენტრატორში ჩაშენებული FTA® ნაკადის მემბრანაში, რაც იძლევა ნუკლეინის მჟავის ეფექტურ წარმოებას [50] (ნახ. 2c).ნუკლეინის მჟავის გამოვლენის მთავარი პრობლემა FTA ბარათების გამოყენებით არის ის, რომ ქიმიკატები, როგორიცაა გუანიდინი და იზოპროპანოლი, აფერხებენ შემდგომ გამაძლიერებელ რეაქციებს.ამ პრობლემის გადასაჭრელად, ჩვენ შევიმუშავეთ Fusion 5 ჩიტოზანით მოდიფიცირებული ფილტრის ქაღალდი, რომელიც აერთიანებს დნმ-ის მოლეკულების და ბოჭკოვანი ფილტრის ქაღალდის ფიზიკური შეჯვარების უპირატესობებს და დნმ-ის ელექტროსტატიკური ადსორბციას ქიტოზანით მოდიფიცირებულ ნაერთებზე, რათა მივაღწიოთ მაღალეფექტურ ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციას. ..ფილტრის ბოჭკოები [51] (ნახ. 2d).ანალოგიურად, ჟუ ​​და სხვ.[52] აჩვენა ქიტოზანით მოდიფიცირებული PCR მეთოდი, რომელიც დაფუძნებულია in situ კაპილარულ მიკროფლიიდურ სისტემაზე ზიკას ვირუსის რნმ-ის სწრაფი იზოლაციისა და გამოვლენისთვის.ნუკლეინის მჟავები შეიძლება ადსორბირებული/დესორბირებული იყოს შერეულ ლიზატში/PCR გარემოში, შესაბამისად, ქიტოზანის ჩართვის/გამორთვის თვისების საფუძველზე.ჩართვა და გამორთვა”, რეაგირებს pH-ზე.
როგორც ზემოთ აღინიშნა, ეს სტრატეგიები აერთიანებს სხვადასხვა მყარი ფაზის მასალების უპირატესობებს და ზრდის ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციის ეფექტურობას მიკროფლუიდებში.პრაქტიკულ გამოყენებაში, ამ მასალების დიდი რაოდენობით გამოყენება არაეკონომიურია და ამ მასალებით ჩვეულებრივი მასალების ზედაპირული დამუშავების ან ზედაპირული მოდიფიკაციის ფუნქციის შენარჩუნება ასევე შეიძლება.აქედან გამომდინარე, ითვლება, რომ ამ სტრატეგიების განხორციელებამ საპილოტე შესწავლის შემდეგ შეიძლება შეამციროს ხარჯები.
ნუკლეინის მჟავების ტესტირება მიკროსთხევად პლატფორმებზე ხშირად იყენებს ნიმუშის მცირე მოცულობებს (< 100 μl), ამიტომ მოითხოვს სამიზნე ნუკლეინის მჟავების გაძლიერებას სპეციფიური ზონდებით სიგნალად გადასაყვანად, რომელიც მოსახერხებელია ქვედა დინების აღმოჩენისთვის (ოპტიკური, ელექტრული და მაგნიტური) [53, 54]. ნუკლეინის მჟავების ტესტირება მიკროსთხევად პლატფორმებზე ხშირად იყენებს ნიმუშის მცირე მოცულობებს (< 100 μl), ამიტომ მოითხოვს სამიზნე ნუკლეინის მჟავების გაძლიერებას სპეციფიური ზონდებით სიგნალად გადასაყვანად, რომელიც მოსახერხებელია ქვედა დინების აღმოჩენისთვის (ოპტიკური, ელექტრული და მაგნიტური) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. მიკროსთხევად პლატფორმებზე ნუკლეინის მჟავების ტესტირებისას ხშირად გამოიყენება ნიმუშის მცირე მოცულობები (<100 μL), ამიტომ საჭიროა სამიზნე ნუკლეინის მჟავების გაძლიერება სპეციალური ზონდებით, რათა ის გარდაიქმნას შემდგომი აღმოჩენისთვის მოსახერხებელ სიგნალად (ოპტიკური, ელექტრული და მაგნიტური). [53, 54].. ].. ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. ნუკლეინის მჟავების გამოვლენა მიკროსთხევად პლატფორმებზე ჩვეულებრივ იყენებს მცირე ნიმუშის მოცულობას (<100 μl), რაც მოითხოვს სამიზნე ნუკლეინის მჟავების გაძლიერებას სპეციალური ზონდებით, რათა გარდაიქმნას ისინი სიგნალებად შემდგომი აღმოჩენისთვის (ოპტიკური, ელექტრული და მაგნიტური) [53, 54] .ნუკლეინის მჟავის გაძლიერება მიკროფლუიდებში ასევე შეუძლია დააჩქაროს რეაქციები, ოპტიმიზაცია მოახდინოს გამოვლენის ლიმიტები, შეამციროს ნიმუშის მოთხოვნები და გააუმჯობესოს გამოვლენის სიზუსტე [55, 56].ბოლო წლებში, სწრაფი და ზუსტი გამოვლენის რეალიზებით, მიკროფლუიდიკაში გამოიყენება ნუკლეინის მჟავების ამპლიფიკაციის სხვადასხვა მეთოდი, მათ შორის PCR და ზოგიერთი იზოთერმული ამპლიფიკაციის რეაქცია.ეს განყოფილება შეაჯამებს ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის მეთოდებს მიკროფლუიდური სისტემების საფუძველზე.
PCR არის ორგანიზმის დნმ-ის რეპლიკაციის პროცესის სიმულაცია, რომლის თეორია დეტალურად არის აღწერილი სხვაგან და აქ არ იქნება განხილული.PCR-ს შეუძლია გააძლიეროს სამიზნე დნმ/რნმ-ის ძალიან მცირე რაოდენობა ექსპონენციალური სიჩქარით, რაც აქცევს PCR-ს მძლავრ ინსტრუმენტად ნუკლეინის მჟავების სწრაფი გამოვლენისთვის.ბოლო ათწლეულების განმავლობაში, მრავალი პორტატული მიკროსთხევადი მოწყობილობა, რომელიც აღჭურვილია PCR თერმოციკლური სისტემებით, შემუშავებულია მოვლის წერტილის დიაგნოსტიკის საჭიროებების დასაკმაყოფილებლად [57, 58].ჩიპზე PCR შეიძლება დაიყოს ოთხ ტიპად (ჩვეულებრივი, უწყვეტი ნაკადი, სივრცით ჩართული და კონვექციური PCR) ტემპერატურის კონტროლის სხვადასხვა მეთოდების მიხედვით [59].მაგალითად, Gee et al.[60] შეიმუშავეს პირდაპირი საპირისპირო ტრანსკრიფციის რაოდენობრივი PCR (RT-qPCR) მეთოდი საკუთარ მიკროფლუიდური პლატფორმაზე SARS-CoV-2, გრიპის A და B ვირუსების მულტიპლექსური გამოვლენისთვის ყელის ნაცხის ნიმუშებში (ნახ. 3a).პარკი და სხვ.[61] ააშენა მარტივი პათოგენის ანალიზის ჩიპი თხელი ფირის PCR-ის, ელექტროდების და თითით მოქმედი პოლიდიმეთილსილოქსანის მიკროფლუიდური მოდულის ინტეგრირებით.თუმცა, ორივე ნამუშევარი მოიცავს ჩვეულებრივი PCR-ის საერთო ნაკლოვანებებს.PCR მოითხოვს თერმულ ციკლს, რაც ზღუდავს მოწყობილობის შემდგომ მინიატურიზაციას და შემცირებულ ტესტირების დროს.
უწყვეტ ნაკადზე დაფუძნებული მიკროფლუიდური და კოსმოსური გადართვის PCR-ის შემუშავება გადამწყვეტია ამ საკითხის მოსაგვარებლად.გრძელი სერპენტინური არხის ან მოკლე სწორი არხის გამოყენებით, უწყვეტი ნაკადის PCR-ს შეუძლია უზრუნველყოს სწრაფი გაძლიერება რეაგენტების აქტიური ცირკულირებით სამ წინასწარ გახურების ზონაში ჩიპური ტუმბოს საშუალებით.ეს ოპერაცია წარმატებით აცილებს გარდამავალ ფაზას სხვადასხვა რეაქციის ტემპერატურას შორის და ამით მნიშვნელოვნად ამცირებს ტესტირების დროს [62] (ნახ. 3b).იუნგის და სხვათა სხვა კვლევაში.[63] შემოგვთავაზა ახალი მბრუნავი PCR გენეტიკური ანალიზატორი, რომელიც აერთიანებს ფიქსირებული და ნაკადის PCR-ის მახასიათებლებს ულტრასწრაფი და მულტიპლექსური საპირისპირო ტრანსკრიფციის PCR-სთვის (ნახ. 3c).ნუკლეინის მჟავას ამპლიფიკაციისთვის, PCR მიკროჩიპი შემობრუნდება სამი გამათბობელი ბლოკით სხვადასხვა ტემპერატურაზე: 1. დენატურაციის ბლოკი 94°C, 2. ანეილირების ბლოკი 58°C-ზე, 3. გაფართოების ბლოკი 72°C-ზე.
PCR-ის გამოყენება მიკროფლუიდიკაში.dirRT-qPCR-ის სქემატური წარმოდგენა მიკროფლუიდური პლატფორმაზე (ადაპტირებულია [60]-დან).b უწყვეტი ნაკადის PCR მიკროსქემის სქემატური წარმოდგენა სერპენტინურ არხზე (ადაპტირებულია [62]-დან).გ მბრუნავი PCR გენეტიკური ანალიზატორის სქემატური წარმოდგენა, რომელიც შედგება მიკროჩიპისგან, სამი გამათბობელი ბლოკისგან და სტეპერ ძრავისგან (ადაპტირებულია [63]-დან).d თერმოკონვექციური PCR-ის დიაგრამა ცენტრიფუგაციით და დაყენებით (ადაპტირებულია [64]-დან).DirRT-qPCR, პირდაპირი რაოდენობრივი საპირისპირო ტრანსკრიფციის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია
კაპილარების და მარყუჟების ან თუნდაც თხელი ფირფიტების გამოყენებით, კონვექციურ PCR-ს შეუძლია სწრაფად გააძლიეროს ნუკლეინის მჟავები ბუნებრივი თავისუფალი თერმული კონვექციის საშუალებით გარე ტუმბოს საჭიროების გარეშე.მაგალითად, ციკლური ოლეფინის პოლიმერული მიკროსთხევადი პლატფორმა შეიქმნა შემუშავებულ მბრუნავ გათბობის საფეხურზე, რომელიც იყენებს თერმულ ციკლს ცენტრიფუგაციით PCR მარყუჟის მიკროარხში [64] (ნახ. 3d).რეაქციის ხსნარს ამოძრავებს თერმული კონვექცია, რომელიც განუწყვეტლივ ცვლის მაღალ და დაბალ ტემპერატურას რგოლოვანი სტრუქტურის მქონე მიკროარხში.გაძლიერების მთელი პროცესი შეიძლება დასრულდეს 10 წუთში 70,5 პგ/არხზე გამოვლენის ლიმიტით.
როგორც მოსალოდნელი იყო, სწრაფი PCR არის მძლავრი ინსტრუმენტი სრულად ინტეგრირებული ნიმუშის პასუხზე მოლეკულური დიაგნოსტიკური და მულტიპლექსური ანალიზის სისტემებისთვის.სწრაფი PCR მნიშვნელოვნად ამცირებს SARS-CoV-2-ის გამოვლენისთვის საჭირო დროს, რაც ხელს უწყობს COVID-19 პანდემიის ეფექტურ კონტროლს.
PCR მოითხოვს კომპლექსურ თერმოციკლერს, რომელიც არ არის შესაფერისი POCT-ისთვის.ახლახან, იზოთერმული ამპლიფიკაციის ტექნიკა იქნა გამოყენებული მიკროფლუიდების მიმართ, მათ შორის, მაგრამ არ შემოიფარგლება მხოლოდ LAMP-ით, რეკომბინაზული პოლიმერაზას გაძლიერებით (RPA) და ნუკლეინის მჟავების თანმიმდევრობებზე დაფუძნებული გაძლიერებით [65,66,67,68].ამ ტექნიკით ნუკლეინის მჟავები ძლიერდება მუდმივ ტემპერატურაზე, რაც ხელს უწყობს მოლეკულური დიაგნოსტიკისთვის იაფი, მაღალმგრძნობიარე პორტატული POCT მოწყობილობების შექმნას.
მაღალი გამტარუნარიანობის მიკროფლუიდიებზე დაფუძნებული LAMP ანალიზები იძლევა ინფექციური დაავადებების მრავალჯერად გამოვლენას [42, 69, 70, 71].ცენტრიდანული მიკროფლუიდური სისტემასთან ერთად, LAMP-ს შეუძლია კიდევ უფრო გაუადვილოს ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის ავტომატიზაცია [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip შეიქმნა მრავალი პარალელური ბაქტერიის ვიზუალური გამოვლენისთვის LAMP-ის გამოყენებით [76] (ნახ. 4a).ანალიზში ოპტიმიზებული LAMP-ის გამოყენებისას, ფლუორესცენციის სიგნალი-ხმაურის თანაფარდობა იყო დაახლოებით 5-ჯერადი და აღმოჩენის ლიმიტი აღწევდა გენომიური დნმ-ის 7.2 ასლი/μl. გარდა ამისა, ხუთი საერთო საჭმლის მომნელებელი ბაქტერიული პათოგენის არსებობა, მათ შორის Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis და Vibrio parahaemolyticus, ვიზუალურად იქნა გამოყენებული მეთოდის საფუძველზე <60 წუთში. გარდა ამისა, ხუთი საერთო საჭმლის მომნელებელი ბაქტერიული პათოგენის არსებობა, მათ შორის Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis და Vibrio parahaemolyticus, ვიზუალურად იქნა გამოყენებული მეთოდის საფუძველზე <60 წუთში.უფრო მეტიც, საჭმლის მომნელებელი ტრაქტის ხუთი საერთო ბაქტერიული პათოგენის არსებობა, მათ შორის Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis და Vibrio parahaemolyticus, ვიზუალური იყო ამ მეთოდის გამოყენებით 60 წუთზე ნაკლებ დროში..此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 肠 氏 菌 、 弧菌 副溶血 性 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPგარდა ამისა, ხუთი საერთო ბაქტერიული კუჭ-ნაწლავის პათოგენის არსებობა, მათ შორის, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius და Vibrio parahaemolyticus, ვიზუალური იყო ამ მეთოდის გამოყენებით 60 წუთზე ნაკლებ დროში.
LAMP-ის უპირატესობები მიკროფლუიდიკაში მოიცავს, სხვათა შორის, სწრაფი რეაგირება და მინიატურული გამოვლენა.თუმცა, რეაქციის ტემპერატურის გამო (დაახლოებით 70°C), აეროზოლები აუცილებლად წარმოიქმნება LAMP-ის დროს, რაც იწვევს მაღალი ცრუ დადებითი მაჩვენებელი.ანალიზის სპეციფიკა, პრაიმერის დიზაინი და ტემპერატურის კონტროლი ასევე უნდა იყოს ოპტიმიზირებული LAMP-ისთვის.გარდა ამისა, ჩიპების დიზაინები, რომლებიც ახორციელებენ მრავალჯერადი სამიზნის აღმოჩენას ერთ ჩიპზე, დიდი მნიშვნელობა აქვს და უნდა განვითარდეს.გარდა ამისა, LAMP შესაფერისია ერთ ჩიპში ინტეგრირებული მრავალფუნქციური გამოვლენისთვის, რასაც დიდი მნიშვნელობა აქვს, მაგრამ განვითარებისთვის ჯერ კიდევ ბევრი ადგილია.
LAMP-ის მაღალი ცრუ დადებითი მაჩვენებელი შეიძლება ნაწილობრივ შემცირდეს RPA-ით, რადგან რეაქციის შედარებით დაბალი ტემპერატურა (~37 °C) იწვევს შედარებით მცირე აორთქლების პრობლემებს [77].RPA სისტემაში ორი საპირისპირო პრაიმერი იწყებს დნმ-ის სინთეზს რეკომბინაზასთან შეკავშირებით და ამპლიფიკაცია შეიძლება დასრულდეს 10 წუთში [78,79,80,81].ამიტომ, მთელი RPA პროცესი ბევრად უფრო სწრაფია, ვიდრე PCR ან LAMP.ბოლო წლებში ნაჩვენებია, რომ მიკროფლუიდური ტექნოლოგია კიდევ უფრო აუმჯობესებს RPA-ს სიჩქარეს და სიზუსტეს [82,83,84].მაგალითად, ლიუ და სხვ.[85] შეიმუშავა მიკროფლუიდური ინტეგრირებული გვერდითი ნაკადის პოლიმერაზა რეკომბინაზას ამპლიფიკაციის ანალიზი SARS-CoV-2-ის სწრაფი და მგრძნობიარე გამოვლენისთვის, უკუ ტრანსკრიფციის RPA (RT-RPA) და უნივერსალური გვერდითი ნაკადის ტესტის ზოლების გამოვლენის სისტემის ინტეგრირებით.ერთ მიკროსთხევად სისტემაში.სურათი 4b).აღმოჩენის ლიმიტი არის 1 ასლი/μl ან 30 ეგზემპლარი/ნიმუში და აღმოჩენა შეიძლება დასრულდეს დაახლოებით 30 წუთში.კონგი და სხვ.შეიმუშავეს ტარებადი მიკროსთხევადი მოწყობილობა.[86] გამოიყენა სხეულის ტემპერატურა და მობილურ ტელეფონზე დაფუძნებული ფლუორესცენციის გამოვლენის სისტემა, რათა სწრაფად და პირდაპირ აღმოაჩინოს აივ-1 დნმ RPA-ს გამოყენებით (სურათი 4c).ტარებადი RPA ანალიზი აღმოაჩენს სამიზნე თანმიმდევრობის 100 ასლს/მლ 24 წუთში, რაც აჩვენებს აივ-1-ით ინფიცირებული ჩვილების სწრაფი დიაგნოსტიკის დიდ პოტენციალს რესურსებით შეზღუდულ პირობებში.
იზოთერმული გაძლიერება მოვლის წერტილში ტესტირებაში (POCT).სპინისა და რეაქციის SlipChip-ის შემუშავება და წარმოება.პლაზმური შედუღების შემდეგ, ზედა და ქვედა ჩიპები აწყობილი იქნა თხილის ნაკრებით საბოლოო ჩიპის შესაქმნელად (ადაპტირებულია [76]-დან).b COVID-19-ის გამოვლენის MI-IF-RPA სისტემის სქემა (ადაპტირებულია [85]-დან).c ჩასაცმელი RPA ტესტის სქემა აივ-1 დნმ-ის სწრაფი გამოვლენისთვის (ადაპტირებულია [86]-დან).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM კარბოქსიფლუორესცეინი, ადამიანის იმუნოდეფიციტის ვირუსი აივ, RPA რეკომბინაზას პოლიმერაზას გაძლიერება, LED სინათლის ასხივებენ დიოდი, MI-IFLUP-ის ინტეგრირებული MI-IF-R გაძლიერება
მიკროთხევადზე დაფუძნებული RPA სწრაფად ვითარდება, თუმცა, ჩიპების დამზადებისა და რეაქციის მოხმარების ღირებულება ძალიან მაღალია და უნდა შემცირდეს ამ ტექნოლოგიის ხელმისაწვდომობის გასაზრდელად.გარდა ამისა, RPA-ს მაღალმა მგრძნობელობამ შეიძლება გავლენა მოახდინოს არასპეციფიკური პროდუქტების გაძლიერებაზე, განსაკუთრებით დაბინძურების არსებობისას.ამ შეზღუდვებმა შეიძლება გავლენა მოახდინოს RPA-ს გამოყენებაზე მიკროსთხევად სისტემებში და იმსახურებს შემდგომ ოპტიმიზაციას.ასევე საჭიროა კარგად შემუშავებული პრაიმერები და ზონდები სხვადასხვა სამიზნეებისთვის RPA-ზე დაფუძნებული მიკროფლიდური სტრატეგიების მიზანშეწონილობის გასაუმჯობესებლად POCT-ში.
Cas13-ს და Cas12a-ს აქვთ ნუკლეინის მჟავების შემთხვევით დაშლის უნარი და, შესაბამისად, შეიძლება განვითარდეს როგორც გამოვლენის და დიაგნოსტიკური საშუალებები.Cas13 და Cas12a აქტიურდებიან სამიზნე დნმ-თან ან რნმ-თან შეკავშირებისას, შესაბამისად.გააქტიურების შემდეგ, ცილა იწყებს სხვა ახლომდებარე ნუკლეინის მჟავების დაშლას, რის შემდეგაც სახელმძღვანელო რნმ-ებს, რომლებიც მიმართულია პათოგენისთვის სპეციფიკურ ნუკლეინის მჟავებზე, შეუძლიათ დაშალონ ჩამქრალი ფლუორესცენტური ზონდები და გაათავისუფლონ ფლუორესცენცია.ამ თეორიაზე დაყრდნობით კელნერი და სხვ.[87] შეიმუშავა Cas13-ზე დაფუძნებული მეთოდი [Specific High-Sensitive Enzymatic Reporter Unlocking (SHERLOCK)] და Broughton et al.[88] შეიმუშავა სხვა მიდგომა Cas12a-ზე დაფუძნებული [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
ბოლო წლებში გამოჩნდა ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის სხვადასხვა მეთოდი CRISPR-ზე დაფუძნებული [89, 90].CRISPR-ზე დაფუძნებული ჩვეულებრივი მეთოდები ხშირად შრომატევადია და შრომატევადია მრავალი პროცედურების გამო, მათ შორის ნუკლეინის მჟავას მოპოვება, გაძლიერება და CRISPR გამოვლენა.სითხეების ჰაერზე ზემოქმედებამ შეიძლება გაზარდოს ცრუ დადებითი შედეგების შანსი.ზემოაღნიშნულიდან გამომდინარე, CRISPR-ზე დაფუძნებულ სისტემებს უკიდურესად სჭირდებათ ოპტიმიზაცია.
CRISPR-Cas12a და CRISPR-Cas13a გამოვლენის აპლიკაციებისთვის შემუშავებულია პნევმატური კონტროლირებადი მიკროსთხევადი პლატფორმა, რომელსაც შეუძლია 24 ანალიზის პარალელურად შესრულება [91].სისტემა აღჭურვილია ფლუორესცენციის გამოვლენის მოწყობილობით, რომელიც გვერდის ავლით ნუკლეინის მჟავას გაძლიერებას და ავტომატურად აღმოაჩენს ფემტომოლარული დნმ-ისა და რნმ-ის ნიმუშებს.ჩენი და სხვ.[92] ინტეგრირებული რეკომბინაზას ამპლიფიკაცია CRISPR-Cas12a სისტემით ცენტრიდანულ მიკროფლუიდიკაში (ნახ. 5a).ეს ნამუშევარი გადალახავს ამ ორი პროცესის ინტეგრაციის სირთულეს, რადგან Cas12a-ს შეუძლია მესინჯერის დნმ-ის მონელება და ამპლიფიკაციის პროცესის დათრგუნვა.გარდა ამისა, ჩენი და სხვ.[92] დამატებით წინასწარ ინახებოდა რეაქციის რეაგენტები ცენტრიდანულ მიკროსთხევად კონტროლში, რათა ავტომატურად დასრულდეს მთელი პროცესი.სხვა ნაშრომში სილვა და სხვ.[93] შეიმუშავა დიაგნოსტიკური მეთოდი CRISPR/Cas12a გაძლიერების და სმარტფონის გარეშე SARS-CoV-2-ის გამოსავლენად (ნახ. 5b).ეს ანალიზი, რომელიც ცნობილია როგორც მობილურ ტელეფონზე დაფუძნებული ამპლიფიკაციისგან თავისუფალი სისტემა, მოიცავს CRISPR/Cas-ზე დამოკიდებულ ფერმენტს, რომელიც ეფუძნება სმარტფონის ვიზუალიზაციას კატალაზას წარმოქმნილი ბუშტების სიგნალების მიკროსთხევად არხებში.ნუკლეინის მჟავას 50 ასლი/მკლ-ზე ნაკლები სენსიტიური გამოვლენა წინასწარი გაძლიერების გარეშე, მთელი პროცესი ნიმუშის ინექციიდან სიგნალის წაკითხვამდე მხოლოდ 71 წუთს იღებს.
ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის მეთოდები CRISPR-ზე დაფუძნებული.ცენტრიფუგა POCT ინტეგრირებული მოლეკულური დიაგნოსტიკისთვის CRISPR-ზე დაფუძნებული (ადაპტირებულია [92]-დან).b CASCADE ტესტის შემუშავება SARS-CoV-2-ის სმარტფონზე დაფუძნებული ანალიზისთვის (ადაპტირებულია [93]-დან).RAA რეკომბინაზას გაძლიერება, PAM მიმდებარე პროტოსპაკერის მოტივი, CRISPR ჯგუფური მოკლე პალინდრომული გამეორებები რეგულარული ინტერვალებით, CASCADE სისტემა მობილური ტელეფონის გაძლიერების გარეშე CRISPR/CAS-დამოკიდებული ფერმენტებით, 1-ეთილ-3-[3-დიმეთილამინოპროპილ]კარბოდიმიდი EDC ჰიდროქლორიდი
როგორც ნუკლეინის მჟავის გამოვლენის ბოლო ნაბიჯი, სიგნალის გამოვლენა პირდაპირ ასახავს დიაგნოსტიკურ შედეგებს და წარმოადგენს კრიტიკულ ფაქტორს ეფექტური, მგრძნობიარე და ზუსტი POCT-ის შემუშავებაში.სიგნალების წაკითხვა შესაძლებელია სხვადასხვა მეთოდების გამოყენებით, როგორიცაა ფლუორესცენტური, ელექტროქიმიური, კოლორიმეტრიული და მაგნიტური სტრატეგიები.ამ განყოფილებაში ჩვენ აღვწერთ თითოეული მიდგომის დასაბუთებას და შევადარებთ ინფექციური დაავადებების მოლეკულურ დიაგნოზს მიკროფლუიდიკაში.
ფლუორესცენციაზე დაფუძნებული სტრატეგიები ფართოდ გამოიყენება ინფექციური დაავადებების POCT დიაგნოსტიკისთვის შესანიშნავი მგრძნობელობის, დაბალი ღირებულების, ოპერაციის სიმარტივის და მოვლის წერტილის ანალიზის შესანიშნავი უპირატესობების გამო [94, 95].ეს სტრატეგიები იყენებენ ეტიკეტირებულ ფტორფორებს, როგორიცაა ფლუორესცენტური საღებავები და ნანომასალები, რათა შეიქმნას შესამჩნევი სიგნალი (ფლუორესცენციის გაძლიერება ან ჩაქრობა).ეს დასკვნა ვარაუდობს, რომ ფლუორესცენტზე დაფუძნებული სტრატეგიები შეიძლება დაიყოს პირდაპირ ფლუორესცენტულ მარკირებად, სიგნალის ჩართვისა და სიგნალის გამორთვის ფლუორესცენტულ გამოვლენად [96].პირდაპირი ფლუორესცენტური ეტიკეტის გამოვლენა იყენებს სპეციალურ ფლუორესცენტურ ეტიკეტებს სპეციფიკური ლიგანდების ეტიკეტირებისთვის, რომლებიც წარმოქმნიან ფლუორესცენტის სპეციფიკურ რაოდენობას სამიზნესთან შერჩევითად შეკავშირებისას.სიგნალზე დაფუძნებული ფლუორესცენციის გამოვლენისთვის, ფლუორესცენტური სიგნალის ხარისხი დადებითად არის დაკავშირებული ინტერესის სიდიდესთან.ფლუორესცენციის ინტენსივობა უმნიშვნელოა სამიზნის არარსებობისას და შესამჩნევია სამიზნის საკმარისი რაოდენობის არსებობისას.პირიქით, ფლუორესცენციის ინტენსივობა, რომელიც გამოვლენილია „სიგნალის გამორთვის“ ფლუორესცენციით, უკუპროპორციულია სამიზნის ოდენობასთან, თავდაპირველად აღწევს მაქსიმალურ მნიშვნელობას და თანდათან მცირდება სამიზნის გადიდებისას.მაგალითად, CRISPR-Cas13a სამიზნეზე დამოკიდებული ტრანს-გაწყვეტის მექანიზმის გამოყენებით, Tian et al.[97] შეიმუშავა ახალი ამოცნობის სტრატეგია რნმ-ების გამოსავლენად, რომლებიც პირდაპირ გვერდის ავლით უკუ ტრანსკრიფციას (ნახ. 6a).დამატებითი სამიზნე რნმ-ებთან შეერთებისას CRISPR-Cas13-RNA კომპლექსი შეიძლება გააქტიურდეს, რაც გამოიწვევს ტრანსკოლტერალური გახლეჩვას არასპეციფიკური რეპორტიორი რნმ-ებით.ფლუორესცენტურად მონიშნული რეპორტიორი [ფტორფორი (F)] ჩაქრება კვენჩერით (Q) უცვლელი და ფლუორესცირდება, როდესაც გააქტიურებულია კომპლექსით.
ელექტროქიმიური გამოვლენის უპირატესობა არის მაღალი გამოვლენის სიჩქარე, მარტივი წარმოება, დაბალი ღირებულება, მარტივი ტარება და ავტომატური კონტროლი.ეს არის ძლიერი ანალიტიკური მეთოდი POCT აპლიკაციებისთვის.გრაფენის საველე ეფექტის ტრანზისტორებზე დაყრდნობით Gao et al.[98] შეიმუშავა ნანობიოსენსორი ლაიმის დაავადების ანტიგენების მულტიპლექსური გამოვლენისთვის Borrelia burgdorferi ბაქტერიებიდან, 2 პგ/მლ გამოვლენის ლიმიტით (ნახ. 6ბ).
ფერომეტრიული ანალიზები გამოყენებულია POCT აპლიკაციებში, რაც სარგებლობს პორტაბელურობის, დაბალი ფასის, მომზადების სიმარტივის და ვიზუალური წაკითხვის უპირატესობებით.კოლორიმეტრულ გამოვლენას შეუძლია გამოიყენოს პეროქსიდაზას ან პეროქსიდაზას მსგავსი ნანომასალების დაჟანგვა, ნანომასალების აგრეგაცია და ინდიკატორის საღებავების დამატება სამიზნე ნუკლეინის მჟავების არსებობის შესახებ ინფორმაციის ფერის ხილულ ცვლილებებად გადაქცევისთვის [99, 100, 101].აღსანიშნავია, რომ ოქროს ნანონაწილაკები ფართოდ გამოიყენება კოლორიმეტრული სტრატეგიების შემუშავებაში და მათი სწრაფი და მნიშვნელოვანი ფერის ცვლილებების გამოწვევის უნარის გამო, იზრდება ინტერესი ინფექციური დაავადებების in situ დიაგნოსტიკისთვის POCT ფერომეტრიული პლატფორმების შემუშავებისადმი [102].ინტეგრირებული ცენტრიდანული მიკროფლუიდური მოწყობილობით [103], დაბინძურებული რძის ნიმუშებში საკვებით გადამდები პათოგენები შეიძლება ავტომატურად გამოვლინდეს 10 ბაქტერიული უჯრედის დონეზე და შედეგების ვიზუალურად წაკითხვა შესაძლებელია 65 წუთში (ნახ. 6c).
მაგნიტური ზონდირების ტექნიკას შეუძლია ზუსტად აღმოაჩინოს ანალიზები მაგნიტური მასალების გამოყენებით და ბოლო ათწლეულების განმავლობაში მნიშვნელოვანი ინტერესი იყო POCT აპლიკაციების მიმართ.მაგნიტური ზონდირების ტექნიკას აქვს რამდენიმე უნიკალური უპირატესობა, როგორიცაა იაფი მაგნიტური მასალები, ვიდრე ძვირადღირებული ოპტიკური კომპონენტები.თუმცა, მაგნიტური ველის გამოყენება აუმჯობესებს გამოვლენის ეფექტურობას და ამცირებს ნიმუშის მომზადების დროს [104].გარდა ამისა, მაგნიტური გამოკვლევის შედეგები აჩვენებს მაღალ სპეციფიკურობას, მგრძნობელობას და მაღალი სიგნალი-ხმაურის თანაფარდობას ბიოლოგიური ნიმუშების უმნიშვნელო მაგნიტური ფონის სიგნალის გამო [105].შარმა და სხვ.ინტეგრირებულია მაგნიტური გვირაბის შეერთებაზე დაფუძნებული ბიოსენსორი პორტატულ მიკროჩიპის პლატფორმაში.[106] პათოგენების მულტიპლექსური გამოვლენისთვის (ნახ. 6d).ბიოსენსორები მგრძნობიარედ აღმოაჩენენ პათოგენებისგან იზოლირებულ სუბნანომოლარულ ნუკლეინის მჟავებს.
სიგნალის გამოვლენის ტიპიური მეთოდი.Cas13a-ს ჰიპერლოკალიზებული გამოვლენის კონცეფცია (ადაპტირებულია [97]-დან).b გრაფენის ნანობიოსენსორი FET Lyme GroES scFv-თან ერთად (ადაპტირებულია [98]-დან).c კოლორიმეტრიული ჩვენებები საკვებით გადამდები პათოგენების მულტიპლექსური გამოვლენისთვის ცენტრიდანულ მიკროთხევად ჩიპში: No1 და No3 ნიმუშები სამიზნე პათოგენებით და No2, No4 და No5 ნიმუშები სამიზნე პათოგენების გარეშე (ადაპტირებულია [103]-დან) .d ბიოსენსორი, რომელიც დაფუძნებულია მაგნიტურ გვირაბის შეერთებაზე, მათ შორის პლატფორმა, ჩაშენებული ბლოკირების გამაძლიერებელი, საკონტროლო განყოფილება და ელექტრომომარაგება სიგნალის გენერირების/შეძენისათვის (ადაპტირებულია [106]-დან).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA პოლიმეთილ მეთაკრილატი
ზემოაღნიშნული გამოვლენის მეთოდების შესანიშნავი მახასიათებლების მიუხედავად, მათ ჯერ კიდევ აქვთ უარყოფითი მხარეები.ეს მეთოდები შედარებულია (ცხრილი 1), მათ შორის ზოგიერთი განაცხადი დეტალებით (დადებითი და უარყოფითი მხარეები).
მიკროფლუიდების, მიკროელექტრომექანიკური სისტემების, ნანოტექნოლოგიისა და მასალების მეცნიერების განვითარებით, მიკროფლიდური ჩიპების გამოყენება ინფექციური დაავადებების გამოსავლენად მუდმივად მიიწევს წინ [55,96,107,108].მინიატურული აღჭურვილობისა და სითხეების ზუსტი მანიპულირება ხელს უწყობს დიაგნოსტიკის სიზუსტეს და ხარჯების ეფექტურობას.ამიტომ, შემდგომი განვითარებისთვის, ძალისხმევა გაკეთდა ჩიპების ოპტიმიზაციისა და განახლებისთვის, რის შედეგადაც სხვადასხვა სტრუქტურისა და ფუნქციის მქონე სხვადასხვა მიკროფლუიდური ჩიპი.აქ მოკლედ წარმოგიდგენთ მიკროფლუიდური პლატფორმების რამდენიმე გავრცელებულ ტიპს და შევადარებთ მათ მახასიათებლებს (დადებით და უარყოფით მხარეებს).გარდა ამისა, ქვემოთ ჩამოთვლილი მაგალითების უმეტესობა ძირითადად ყურადღებას ამახვილებს SARS-CoV-2-ის წინააღმდეგ ბრძოლაზე.
LOCC არის ყველაზე გავრცელებული მინიატურული კომპლექსური ანალიტიკური სისტემები და მათი ოპერაციები არის უაღრესად მინიატურული, ინტეგრირებული, ავტომატიზირებული და პარალელიზებული ნიმუშის ინექციისა და მომზადების, ნაკადის კონტროლისა და სითხის გამოვლენისგან [109, 110].სითხეების მანიპულირება ხდება საგულდაგულოდ შემუშავებული გეომეტრიით და მრავალი ფიზიკური ეფექტის ურთიერთქმედებით, როგორიცაა წნევის გრადიენტები, კაპილარული მოქმედება, ელექტროდინამიკა, მაგნიტური ველები და აკუსტიკური ტალღები [111].LOCC აჩვენებს შესანიშნავ უპირატესობებს მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგსა და მრავალჯერად გამოვლენაში, სწრაფი ანალიზის სიჩქარით, მცირე ნიმუშის ზომით, დაბალი ენერგიის მოხმარებით და მართვისა და მუშაობის მაღალი ეფექტურობით;თუმცა, LOCC მოწყობილობები ძალიან დელიკატურია და წარმოების, შეფუთვისა და ინტერფეისის.თუმცა, მულტიპლექსირება და ხელახალი გამოყენება უზარმაზარ სირთულეებს აწყდება [96].სხვა პლატფორმებთან შედარებით, LOCC-ს აქვს უნიკალური უპირატესობები განაცხადის მაქსიმალური მრავალფეროვნებისა და საუკეთესო ტექნოლოგიების თავსებადობის თვალსაზრისით, მაგრამ ასევე აშკარაა მისი უარყოფითი მხარეები, კერძოდ, მაღალი სირთულე და ცუდი განმეორებადობა.გარე ტუმბოებზე დამოკიდებულება, რომლებიც ხშირად მოცულობითი და ძვირია, კიდევ უფრო ზღუდავს მათ გამოყენებას POCT-ში.
COVID-19-ის გავრცელების დროს LOCC-მ დიდი ყურადღება მიიპყრო.ამავდროულად, არსებობს რამდენიმე ახალი ჩიპი, რომელიც აერთიანებს რამდენიმე ტექნოლოგიას.მაგალითად, სმარტფონები ახლა ფართოდ გამოიყენება როგორც პორტატული ანალიტიკური მოწყობილობები და აქვთ LOCC ინტეგრაციის დიდი პოტენციალი.მზე და სხვ.[21] დაამზადა მიკროფლუიდური ჩიპი, რომელიც საშუალებას აძლევს ხუთი პათოგენის სპეციფიკური ნუკლეინის მჟავების თანმიმდევრობის მულტიპლექსირებას, მათ შორის SARS-CoV-2-ს, LAMP-ის გამოყენებით და გააანალიზა ისინი სმარტფონის გამოყენებით რეაქციის დასრულებიდან 1 საათის განმავლობაში.როგორც სხვა მაგალითი, Sundah et al.[112] შექმნა მოლეკულური გადამრთველი [კატალიზური გაძლიერება მოლეკულური გარდამავალი მდგომარეობის გადამრთველით (CATCH)] SARS-CoV-2 რნმ-ის სამიზნეების პირდაპირი და მგრძნობიარე აღმოჩენისთვის სმარტფონების გამოყენებით. CATCH თავსებადია პორტატული LOCC-თან და აღწევს უმაღლეს შესრულებას (დაახლოებით 8 რნმ ასლი/μl; < 1 სთ ოთახის ტემპერატურაზე) [112]. CATCH თავსებადია პორტატული LOCC-თან და აღწევს უმაღლეს შესრულებას (დაახლოებით 8 რნმ ასლი/μl; < 1 სთ ოთახის ტემპერატურაზე) [112]. CATCH ერთად ჩავრთეთ პორტატივიმ LOCC და სარგებლობს გადამყვანი მწარმოებლობით (მაგალითად 8 კოპიй РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температура) [112]. CATCH თავსებადია პორტატულ LOCC-თან და უზრუნველყოფს შესანიშნავ გამტარუნარიანობას (დაახლოებით 8 რნმ ასლი/μl; < 1 სთ ოთახის ტემპერატურაზე) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 რნმ 拷贝/μl；室温下< 1 小时]〧[112） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 რნმ 拷贝/μl；室温下< 1 小时]〧[112） CATCH ჩართული ერთად პორტატიული LOCC და ავრცელებს ავტორიზაციას (მაგალითად, 8 კოპიй РНК/мкл; < 1 საათი при комнатной температура) [112]. CATCH თავსებადია პორტატულ LOCC-ებთან და აქვს შესანიშნავი შესრულება (დაახლოებით 8 რნმ ასლი/μl; < 1 საათი ოთახის ტემპერატურაზე) [112].გარდა ამისა, მოლეკულური დიაგნოსტიკისთვის LOCC მოწყობილობები ასევე იყენებენ ზოგიერთ მამოძრავებელ ძალას, როგორიცაა ვაკუუმი, გაჭიმვა და ელექტრული ველები.კანგი და სხვ.[113] აჩვენა რეალურ დროში, ულტრა სწრაფი ნანოპლაზმა-ჩიპზე PCR COVID-19-ის სწრაფი და რაოდენობრივი დიაგნოსტიკისთვის მინდორში ვაკუუმ პლაზმური თხევადი PCR ჩიპის გამოყენებით.ლი და სხვ.[114] შემდგომში შეიმუშავა გაჭიმვაზე ორიენტირებული მიკროფლუიდური ჩიპი, რომელმაც საშუალება მისცა COVID-19-ის დიაგნოზირებას.პლატფორმა იყენებს RT-LAMP გამაძლიერებელ სისტემას, რათა დადგინდეს ნიმუში ხარისხობრივად დადებითია თუ უარყოფითი.შემდგომში რამაჩანდრანი და სხვ.[115] მიაღწია შესაბამის ელექტრული ველის გრადიენტებს იზოტოქოფორეზის (ITP) გამოყენებით, შერჩევითი იონების ფოკუსირების ტექნიკით დანერგილი მიკროფლუიდიკაში.ITP-ით, ნაზოფარინგეალური ნაცხის ნედლი ნიმუშებიდან სამიზნე რნმ შეიძლება ავტომატურად გაიწმინდოს.შემდეგ რამაჩანდრანი და სხვ.[115] ამ ITP გამწმენდის კომბინაციით ITP-ით გაძლიერებულ LAMP-თან და CRISPR ანალიზებთან ერთად გამოვლინდა SARS-CoV-2 ადამიანის ცხვირ-ხახის ტამპონში და კლინიკურ ნიმუშებში დაახლოებით 35 წუთში.გარდა ამისა, მუდმივად ჩნდება ახალი იდეები.ჯადჰავმა და სხვებმა.[116] შემოგვთავაზა დიაგნოსტიკური სქემა, რომელიც დაფუძნებულია ზედაპირის გაძლიერებულ რამანის სპექტროსკოპიაზე, მიკროსთხევად მოწყობილობასთან კომბინაციაში, რომელიც შეიცავს ვერტიკალურად ორიენტირებულ ოქროს/ვერცხლის დაფარული ნახშირბადის ნანომილებს ან ერთჯერად ელექტროდაწნულ მიკრო/ნანომილებს.მემბრანული ფუნქციონალიზებული ჩაშენებული ფილტრის მიკროარხები არის ერთჯერადი.მოწყობილობა შთანთქავს ვირუსებს სხეულის სხვადასხვა სითხეებიდან/ექსუდაციებიდან, როგორიცაა ნერწყვი, ნაზოფარინქსი და ცრემლები.ამრიგად, ვირუსის ტიტრი უხვია და ვირუსის ზუსტად იდენტიფიცირება შესაძლებელია რამანის ხელმოწერით.
LOAD არის ცენტრიდანული მიკროსთხევადი პლატფორმა, რომელშიც ყველა პროცესი კონტროლდება სიხშირის პროტოკოლით, რომელიც ბრუნავს მიკროსტრუქტურულ სუბსტრატს [110].LOAD მოწყობილობა ხასიათდება ცენტრიდანული ძალის გამოყენებით, როგორც მნიშვნელოვანი მამოძრავებელი ძალა.სითხეები ასევე ექვემდებარება კაპილარულ, ეილერის და კორიოლის ძალებს.ცენტრიფუგის მოწყობილობის გამოყენებით, ანალიზები ტარდება უწყვეტი სითხის მუშაობისას, რადიალური შიგნიდან გარე პოზიციიდან, რაც გამორიცხავს დამატებითი გარე მილების, ტუმბოების, აქტივატორების და აქტიური სარქველების საჭიროებას.მოკლედ, ერთი კონტროლის მეთოდი ამარტივებს მუშაობას.სითხეზე მოქმედი ძალები იმავე მიკროსთხევად არხში დატვირთვის ცენტრიდან იმავე მანძილზე თანაბარია, რაც შესაძლებელს ხდის არხის სტრუქტურის გამეორებას.ამრიგად, LOAD აღჭურვილობა უფრო მარტივი და ეკონომიურია დიზაინისა და წარმოებისთვის, ვიდრე ჩვეულებრივი LOCC აღჭურვილობა, მაშინ როცა რეაქციები ძირითადად დამოუკიდებელი და პარალელიზებულია;თუმცა, ცენტრიდანული აღჭურვილობის მაღალი მექანიკური სიძლიერის გამო, ხელმისაწვდომი ჩიპური მასალა შეზღუდულია და მცირე მოცულობები რთულია.მანქანამდე.ამავდროულად, LOAD მოწყობილობების უმეტესობა განკუთვნილია მხოლოდ ერთჯერადი გამოყენებისთვის, რაც ძვირია ფართომასშტაბიანი გამოვლენისთვის [96, 117, 118, 119].
ბოლო ათწლეულების განმავლობაში, LOAD-მა, რომელიც ითვლება ერთ-ერთ ყველაზე პერსპექტიულ მიკროსთხევად მოწყობილობად, დიდი ყურადღება მიიპყრო მკვლევართა და მწარმოებლებისგან.ამრიგად, LOAD-მა მოიპოვა ფართო აღიარება და გამოიყენებოდა ინფექციური პათოგენების მოლეკულური დიაგნოსტიკისთვის [120, 121, 122, 123, 124], განსაკუთრებით COVID-19-ის გავრცელების დროს.მაგალითად, 2020 წლის ბოლოს, Ji et al.[60] აჩვენა პირდაპირი RT-qPCR ანალიზი SARS-CoV-2 და გრიპის A და B ინფექციების სწრაფი და ავტომატური პარალელური გამოვლენისთვის ყელის ნაცხის ნიმუშებში.შემდეგ Xiong და სხვ.[74] წარმოადგინა LAMP-ში ინტეგრირებული დისკოიდური მიკროფლუიდური პლატფორმა შვიდი ადამიანის რესპირატორული კოროვირუსის სწრაფი, ზუსტი და ერთდროული გამოვლენისთვის, SARS-CoV-2-ის ჩათვლით, 40 წუთში.2021 წლის დასაწყისში, დე ოლივეირა და სხვ.[73] აჩვენა პოლისტიროლის ტონერის ცენტრიდანული მიკროფლუიდური ჩიპი, ხელით ფუნქციონირებს თითის წვერზე როტაციით, RT-LAMP მოლეკულური დიაგნოზისთვის COVID-19.შემდგომში, დიგნანი და სხვ.[39] წარმოადგინა ავტომატური პორტატული ცენტრიფუგა მიკრომოწყობილობა SARS-CoV-2 რნმ-ის გასაწმენდად პირდაპირ ბუკალური ნაცხის სექციებიდან.მედვედი და სხვ.[53] შესთავაზა SARS-CoV-2 აეროზოლის შერჩევის შიდა სისტემა მცირე მოცულობის მბრუნავი მიკროფლუიდური ფლუორესცენტური ჩიპით, გამოვლენის ლიმიტით 10 ასლი/μL და ციკლის მინიმალური ზღურბლი 15 წუთი.სუარესი და სხვ.[75] ცოტა ხნის წინ მოხსენებული იქნა ინტეგრირებული მოდულური ცენტრიდანული მიკროფლუიდური პლატფორმის შემუშავება SARS-CoV-2 რნმ-ის პირდაპირი გამოვლენისთვის სითბოს ინაქტივირებულ ნაზოფარინგეალური ნაცხის ნიმუშებში LAMP-ის გამოყენებით.ეს მაგალითები აჩვენებს LOAD-ის დიდ სარგებელსა და დაპირებას COVID-19-ის მოლეკულურ დიაგნოსტიკაში.
1945 წელს მიულერმა და კლეგმა [125] პირველად წარმოადგინეს მიკროსთხევადი არხები ქაღალდზე ფილტრის ქაღალდისა და პარაფინის გამოყენებით.2007 წელს Whitesides ჯგუფმა [126] შექმნა პირველი ფუნქციური ქაღალდის პლატფორმა ცილებისა და გლუკოზის ტესტირებისთვის.ქაღალდი გახდა იდეალური სუბსტრატი მიკროფლუიდიკებისთვის.ქაღალდს აქვს თანდაყოლილი თვისებები, როგორიცაა ჰიდროფილურობა და ფოროვანი სტრუქტურა, შესანიშნავი ბიოთავსებადობა, მსუბუქი წონა, მოქნილობა, დასაკეცი, დაბალი ღირებულება, გამოყენების სიმარტივე და მოხერხებულობა.კლასიკური µPAD-ები შედგება ქაღალდის სუბსტრატებზე აგებული ჰიდროფილური/ჰიდროფობიური სტრუქტურებისგან.სამგანზომილებიანი სტრუქტურიდან გამომდინარე, μPADs შეიძლება დაიყოს ორგანზომილებიან (2D) და სამგანზომილებიან (3D) μPAD-ებად.2D μPAD-ები წარმოიქმნება ჰიდროფობიური საზღვრების ფორმირებით მიკროსთხევადი არხების შესაქმნელად, ხოლო 3D μPAD-ები, როგორც წესი, მზადდება 2D მიკროსთხევადი ქაღალდის ფენების დაწყობისგან, ზოგჯერ ქაღალდის დასაკეცვით, სრიალის ტექნიკით, ღია არხებით და 3D ბეჭდვით [96].μPAD-ზე არსებული წყლიანი ან ბიოლოგიური სითხეები ძირითადად კონტროლდება კაპილარული ძალით გარე დენის წყაროს გარეშე, რაც ხელს უწყობს რეაგენტების წინასწარ შენახვას, ნიმუშების დამუშავებას და მულტიპლექსის აღმოჩენას.თუმცა, ნაკადის ზუსტი კონტროლი და მულტიპლექსის გამოვლენა შეფერხებულია არასაკმარისი გამოვლენის სიჩქარით, მგრძნობელობით და ხელახლა გამოყენებადობით [96, 127, 128, 129, 130].
როგორც უჩვეულო მიკროფლუიდური პლატფორმა, μPAD ფართოდ იქნა დაწინაურებული და განვითარებული ინფექციური დაავადებების მოლეკულური დიაგნოსტიკისთვის, როგორიცაა HCV, აივ და SARS-CoV-2 [131, 132].HCV-ის შერჩევითი და მგრძნობიარე გამოვლენისთვის Tengam et al.[133] შეიმუშავა ახალი ბიოსენსორი, რომელიც დაფუძნებულია ფლუორესცენტურ ქაღალდზე, ძალზე სპეციფიური ნუკლეინის მჟავის ზონდის გამოყენებით, რომელიც დაფუძნებულია პიროლიდინილ პეპტიდზე.ნუკლეინის მჟავები კოვალენტურად იმობილირდება ნაწილობრივ დაჟანგული ცელულოზის ქაღალდზე რედუქციური ალკილაციით ამინო ჯგუფებსა და ალდეჰიდურ ჯგუფებს შორის და აღმოჩენა ემყარება ფლუორესცენციას.ამ სიგნალების წაკითხვა შესაძლებელია სპეციალურად დამზადებული გაჯეტით, პორტატული ფლუორესცენტური კამერით, მობილური ტელეფონის კამერასთან ერთად.შემდგომში ლუ და სხვ.[134] დააპროექტა ქაღალდზე დაფუძნებული მოქნილი ელექტროდი, რომელიც დაფუძნებულია ნიკელის/ოქროს ნანონაწილაკებზე/ნახშირბადის ნანომილაკებზე/პოლივინილ ალკოჰოლის ორგანული მეტალის ჩარჩო კომპოზიტებზე აივ მიზნის გამოვლენისთვის დნმ-ის ჰიბრიდიზაციით მეთილენის ლურჯის, როგორც დნმ-ის რედოქსის ინდიკატორის გამოყენებით.ცოტა ხნის წინ, Chowdury et al.[135] წარმოადგინა ჰიპოთეტური პლატფორმის დიზაინი მოვლის წერტილში μPAD ტესტირებისთვის პაციენტის ნედლი ნერწყვის გამოყენებით LAMP-თან და პორტატული ვიზუალიზაციის ტექნოლოგიასთან ერთად COVID-19 ანალიტის გამოვლენისთვის.
გვერდითი ნაკადის ტესტები ხელმძღვანელობს სითხეებს კაპილარული ძალებით და აკონტროლებს სითხის მოძრაობას ფოროვანი ან მიკროსტრუქტურული სუბსტრატების დასველებადობისა და მახასიათებლების მიხედვით.გვერდითი ნაკადის მოწყობილობები შედგება ნიმუშის, კონიუგატის, ინკუბატორისა და დეტექტორისა და შთამნთქმელი ბალიშებისგან.ნუკლეინის მჟავას მოლეკულები LFA-ში ცნობენ სპეციფიკურ შემკვრელებს, რომლებიც წინასწარ ინახება შეკავშირების ადგილზე და აკავშირებენ როგორც კომპლექსები.როდესაც სითხე გადის ინკუბაციისა და აღმოჩენის ფირფიტებში, კომპლექსები იჭერს სატესტო და საკონტროლო ხაზებზე განლაგებულ მოლეკულებს, რაც აჩვენებს შედეგებს, რომელთა წაკითხვა შესაძლებელია პირდაპირ შეუიარაღებელი თვალით.როგორც წესი, LFA შეიძლება დასრულდეს 2-15 წუთში, რაც უფრო სწრაფია ვიდრე ტრადიციული აღმოჩენა.სპეციალური მექანიზმის გამო, LFA მოითხოვს რამდენიმე ოპერაციებს და არ საჭიროებს დამატებით აღჭურვილობას, რაც მას ძალიან მოსახერხებელი ხდის.მისი დამზადება და მინიატურიზაცია მარტივია, ხოლო ქაღალდზე დაფუძნებული სუბსტრატების ღირებულება უფრო დაბალია.თუმცა, ის გამოიყენება მხოლოდ ხარისხობრივი ანალიზისთვის და რაოდენობრივი გამოვლენა ძალიან რთულია, მულტიპლექსირების უნარი და გამტარუნარიანობა ძალიან შეზღუდულია და მხოლოდ ერთი საკმარისი ნუკლეინის მჟავა შეიძლება გამოვლინდეს ერთდროულად [96,110,127].
მიუხედავად იმისა, რომ LFA-ს აპლიკაციების უმეტესობა ორიენტირებულია იმუნოანალიზებზე, LFA-ს გამოყენება მოლეკულური დიაგნოსტიკისთვის მიკროსთხევად ჩიპებში ასევე ეფექტური და პოპულარულია [136].B ჰეპატიტის ვირუსის შემთხვევაში, აივ და SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] შემოგვთავაზა ნანონაწილაკების LFA პლატფორმა ამაღლებული კონვერტაციისთვის და აჩვენა ამ მინიატურული და პორტატული პლატფორმის მრავალფეროვნება მრავალი სამიზნის მგრძნობიარე და რაოდენობრივი გამოვლენის გზით, როგორიცაა HBV ნუკლეინის მჟავა.გარდა ამისა, ფუ და სხვ.[138] აჩვენა ახალი LFA, რომელიც დაფუძნებულია ზედაპირზე გაძლიერებულ რამანის სპექტროსკოპიაზე აივ-1 დნმ-ის რაოდენობრივი ანალიზისთვის დაბალ კონცენტრაციებში.SARS-CoV-2-ის სწრაფი და მგრძნობიარე გამოვლენისთვის, Liu et al.[85] შეიმუშავა მიკროფლუიდური ინტეგრირებული RPA გვერდითი ნაკადის ანალიზი RT-RPA და უნივერსალური გვერდითი ნაკადის გამოვლენის სისტემის კომბინაციით ერთ მიკროსთხევად სისტემაში.
სხვადასხვა მიკროფლუიდური პლატფორმების გამოყენება განსხვავდება კონკრეტული კვლევების მიხედვით, პლატფორმების შესაძლებლობებისა და უპირატესობების სრულად გამოყენებით.ხელმისაწვდომი სარქველებით, ტუმბოებითა და არხებით, LOCC არის ყველაზე ყოვლისმომცველი პლატფორმა აპლიკაციების მრავალფეროვნებისა და თავსებადობისთვის განვითარების უდიდეს სივრცესთან.ამიტომ, ჩვენ ვიმედოვნებთ და გირჩევთ, რომ უახლესი კვლევები ჩატარდეს LOCC-ში, როგორც პირველი მცდელობა და რომ მოხდეს პირობების ოპტიმიზაცია.გარდა ამისა, მოსალოდნელია უფრო ეფექტური და ზუსტი მეთოდების აღმოჩენა და გამოყენება სისტემაში.LOAD აუმჯობესებს სითხეების ზუსტ კონტროლს არსებული LOCC მოწყობილობებიდან და აჩვენებს უნიკალურ უპირატესობებს ცალკეულ დრაივებში ცენტრიდანული ძალით გარე დისკების საჭიროების გარეშე, ხოლო პარალელური პასუხები შეიძლება იყოს ცალკე და სინქრონიზებული.ამრიგად, მომავალში, LOAD გახდება მთავარი მიკროფლუიდური პლატფორმა ნაკლები მექანიკური ოპერაციებით და უფრო მომწიფებული და ავტომატიზირებული ტექნოლოგიებით.µPAD პლატფორმა აერთიანებს LOCC-ისა და ქაღალდზე დაფუძნებული მასალების უპირატესობებს დაბალი ფასის, ერთჯერადი გამოყენების დიაგნოსტიკისთვის.ამიტომ, მომავალი განვითარება ფოკუსირებული უნდა იყოს მოსახერხებელ და კარგად დამკვიდრებულ ტექნოლოგიებზე.გარდა ამისა, LFA კარგად შეეფერება შეუიარაღებელი თვალით გამოვლენას, რაც გვპირდება, რომ შეამცირებს ნიმუშის მოხმარებას და დააჩქარებს გამოვლენას.პლატფორმის დეტალური შედარება ნაჩვენებია ცხრილში 2.
ციფრული ანალიზები ნიმუშს ყოფს მრავალ მიკრორეაქტორად, რომელთაგან თითოეული შეიცავს სამიზნე მოლეკულების დისკრეტულ რაოდენობას [139, 140].ციფრული ანალიზი გვთავაზობს მნიშვნელოვან უპირატესობებს აბსოლუტური რაოდენობების შესასრულებლად ათასობით პარალელური ბიოქიმიური ექსპერიმენტის ერთდროულად და ინდივიდუალურად ჩატარებით მიკრონი მასშტაბის განყოფილებებში და არა უწყვეტ ფაზაში.ტრადიციულ მიკროსთხევადებთან შედარებით, განყოფილების რეაქციებს შეუძლია შეამციროს ნიმუშის მოცულობა, გაზარდოს რეაქციის ეფექტურობა და ადვილად იყოს ინტეგრირებული სხვა ანალიტიკურ მეთოდებთან არხების, ტუმბოების, სარქველების და კომპაქტური დიზაინის გარეშე [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .შემდეგი ორი მეთოდი გამოიყენება ციფრულ ანალიზებში ხსნარების ერთგვაროვანი და ზუსტი გამოყოფის მისაღწევად, მათ შორის რეაგენტები და ნიმუშები, როგორიცაა უჯრედები, ნუკლეინის მჟავები და სხვა ნაწილაკები ან მოლეკულები: (1) წვეთოვანი ემულსიები, რომლებიც იყენებენ თხევადი ინტერფეისის არასტაბილურობას;(2) მასივის დაყოფა ხორციელდება მოწყობილობის გეომეტრიული შეზღუდვებით.პირველ მეთოდში, მიკროარხებში რეაგენტებისა და ნიმუშების შემცველი წვეთები შეიძლება შეიქმნას პასიური მეთოდებით, როგორიცაა ერთობლივი დენი, ჯვარედინი ნაკადი, ნაკადის ფოკუსირება, ეტაპობრივი ემულსიფიკაცია, მიკროარხის ემულსიფიკაცია და მემბრანები ბლანტი ათვლის ძალებით და ემულსიფიკაცია არხის ცვლილებით.ლოკალიზაცია [143, 145, 146, 148, 149] ან აქტიური მეთოდების გამოყენებით [150, 151], რომლებიც შემოაქვს დამატებით ენერგიას ელექტრული, მაგნიტური, თერმული და მექანიკური კონტროლის საშუალებით.ამ უკანასკნელ მიდგომაში, მიკროსთხევად კამერებში სითხის მოცულობის საუკეთესო ერთგვაროვნება იზიარებს იმავე ზომის სივრცითი სტრუქტურების შენახვას, როგორიცაა მიკროღრმები და ზედაპირული მასივები [152,153,154].აღსანიშნავია, რომ წვეთები არის ძირითადი ნაკადის სექციები, რომლებიც ასევე შეიძლება წარმოიქმნას და მანიპულირდეს ელექტროდების მასივებზე ციფრული მიკროფლიდიკის (DMF) საფუძველზე.დიელექტრიკის ელექტროდასველება ერთ-ერთი საუკეთესოდ შესწავლილი DMF თეორიაა, ვინაიდან დიელექტრიკის ელექტროდასველება საშუალებას იძლევა ზუსტი მანიპულირება ინდივიდუალური წვეთებით, აკონტროლებს თხევადი და ასიმეტრიული ელექტრული სიგნალების ფორმას, რომელიც გადის სხვადასხვა მხარეს [141, 144].DMF-ში წვეთების ძირითადი ოპერაციები მოიცავს დახარისხებას, გაყოფას და შერწყმას [151, 155, 156], რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას ანალიზის სხვადასხვა სფეროში, განსაკუთრებით მოლეკულურ გამოვლენაში [157, 158, 159].
ნუკლეინის მჟავის ციფრული გამოვლენა არის მესამე თაობის მოლეკულური დიაგნოსტიკური ტექნოლოგია, რომელიც მიჰყვება ჩვეულებრივ PCR-ს და რაოდენობრივ რეალურ დროში PCR-ს (qPCR), მაღალი გამტარუნარიანობის თანმიმდევრობის და თხევადი ბიოფსიის პარალელურად.ბოლო ორი ათწლეულის განმავლობაში ციფრული ნუკლეინის მჟავები სწრაფად განვითარდა ინფექციური პათოგენების მოლეკულური დიაგნოსტიკის სფეროში [160, 161, 162].ციფრული ნუკლეინის მჟავების გამოვლენის აბსოლუტური რაოდენობრივი განსაზღვრა იწყება ნიმუშების და რეაგენტების ცალკეულ განყოფილებებში შეფუთვით, რათა უზრუნველყოფილ იქნას თითოეულ სამიზნე თანმიმდევრობას თითოეულ ცალკეულ განყოფილებაში შესვლის ერთნაირი ალბათობა.თეორიულად, თითოეულ განყოფილებას შეიძლება მიენიჭოს მრავალი სამიზნე თანმიმდევრობა, ან შეიძლება არ იყოს დამოუკიდებელი მიკრორეაქციის სისტემა.ზემოთ აღწერილი სხვადასხვა სენსორული მექანიზმების საშუალებით, მიკრობული სამიზნე თანმიმდევრობების მქონე განყოფილებები, რომლებიც წარმოქმნიან სიგნალებს გარკვეულ ზღურბლზე ზემოთ, შეიძლება ვიზუალურად იყოს წარმოდგენილი შეუიარაღებელი თვალით ან მანქანით და მონიშნული იყოს როგორც დადებითი, ხოლო სხვა განყოფილებები, რომლებიც წარმოქმნიან სიგნალებს ზღურბლზე ქვემოთ, დადებითად. .უარყოფითი, რაც სიგნალს თითოეული სექციისთვის ლოგიკურად აქცევს.ამრიგად, რეაქციის შემდეგ შექმნილი განყოფილებების რაოდენობის და დადებითი შედეგების სიჩქარის გამოთვლით, ტესტის ნიმუშების ორიგინალური ასლები შეიძლება დაემთხვეს პუასონის განაწილების ფორმულის გამოყენებით სტანდარტული მრუდის საჭიროების გარეშე, რაც საჭიროა რუტინული რაოდენობრივი ანალიზებისთვის, როგორიცაა: როგორც qPCR.[163] ტრადიციულ მოლეკულურ დიაგნოსტიკის მეთოდებთან შედარებით, ციფრული ნუკლეინის მჟავის გამოვლენას აქვს ავტომატიზაციის უფრო მაღალი ხარისხი, ანალიზის უფრო მაღალი სიჩქარე და მგრძნობელობა, ნაკლები რეაგენტები, ნაკლები დაბინძურება და უფრო მარტივი დიზაინი და წარმოება.ამ მიზეზების გამო, ციფრული ანალიზების, განსაკუთრებით წვეთოვანი მეთოდების გამოყენება მოლეკულური დიაგნოსტიკისთვის, რომელიც აერთიანებს გაძლიერებას და სიგნალის წაკითხვის ტექნიკას, კარგად არის შესწავლილი SARS-CoV-2-ის კრიტიკული აფეთქების დროს.მაგალითად, იინი და სხვ.[164] კომბინირებულია წვეთოვანი ციფრული და სწრაფი PCR მეთოდები SARS-CoV-2-ში ORF1ab, N და RNase P გენების გამოსავლენად მიკროფლუიდური ჩიპში.აღსანიშნავია, რომ სისტემამ შეძლო დადებითი სიგნალის იდენტიფიცირება 115 წამში, რაც უფრო სწრაფია ვიდრე ჩვეულებრივი PCR, რაც მიუთითებს მის ეფექტურობაზე მოვლის წერტილში გამოვლენაში (სურათი 7a).დონგი და სხვ.[165], სოუ და სხვ.[157], ჩენი და სხვ.[166] და Alteri et al.[167] ასევე გამოიყენა წვეთოვანი ციფრული PCR (ddPCR) SARS-CoV-2-ის გამოსავლენად მიკროფლუიდური სისტემაში შთამბეჭდავი შედეგებით.აღმოჩენის სიჩქარის შემდგომი გასაუმჯობესებლად, Shen et al.[168] მიაღწია ddPCR-ზე დაფუძნებულ ჩიპის გამოსახულებას სულ მცირე 15 წამში გამოსახულების შეკერვის ტექნიკის გამოყენების გარეშე, რაც აჩქარებს ddPCR ტექნოლოგიის პროცესს ლაბორატორიიდან აპლიკაციამდე.გამოიყენება არა მხოლოდ თერმული გაძლიერების მეთოდები, როგორიცაა PCR, არამედ გამოიყენება იზოთერმული გაძლიერების მეთოდები რეაქციის პირობებისა და სწრაფი რეაგირების გასამარტივებლად.ლუ და სხვ.[71] შეიმუშავა SlipChip წვეთების ანალიზისთვის, რომელსაც შეუძლია წარმოქმნას სხვადასხვა ზომის წვეთები მაღალი სიმკვრივით ერთ საფეხურზე და SARS-CoV-2 ნუკლეინის მჟავების რაოდენობრივი განსაზღვრა ციფრული LAMP-ის გამოყენებით (სურათი 7b).როგორც სწრაფად განვითარებადი ტექნოლოგია, CRISPR-ს ასევე შეუძლია მნიშვნელოვანი როლი შეასრულოს ციფრული ნუკლეინის მჟავების გამოვლენაში მოსახერხებელი კოლორიმეტრიული გამოსახულების საშუალებით, ნუკლეინის მჟავას დამატებითი ლაქების საჭიროების გარეშე.აკერმანი და სხვ.შეიმუშავა კომბინატორიული მატრიცული რეაქცია ნუკლეინის მჟავების მულტიპლექსური შეფასებისთვის.[158] აღმოაჩინა ადამიანთან ასოცირებული 169 ვირუსი, მათ შორის SARS-CoV-2, წვეთებში, რომლებიც შეიცავს CRISPR-Cas13-ზე დაფუძნებულ ნუკლეინის მჟავას გამოვლენის რეაგენტებს მიკროჭის ანალიზში (სურათი 7c).გარდა ამისა, იზოთერმული გამაძლიერებელი და CRISPR ტექნოლოგია შეიძლება გამოყენებულ იქნას ერთსა და იმავე სისტემაში ორივეს უპირატესობების შერწყმისთვის.პარკი და სხვ.[169] CRISPR/Cas12a ციფრული ანალიზი შემუშავდა კომერციულ მიკროსთხევად ჩიპში მოპოვებული და სითბოთი მოკლული SARS-CoV-2-ის გამოსავლენად ერთსაფეხურიან RT-RPA-ზე უფრო მოკლე და მაღალი სიგნალის ფონზე გამოვლენით. დროის თანაფარდობა., უფრო ფართო დინამიური დიაპაზონი და უკეთესი მგრძნობელობა (ნახ. 7დ).ამ მაგალითების ზოგიერთი აღწერა მოცემულია ცხრილში 3.
ტიპიური ციფრული პლატფორმა ნუკლეინის მჟავების გამოვლენისთვის.a სწრაფი ციფრული PCR სამუშაო პროცესი შედგება ოთხი ძირითადი ეტაპისგან: ნიმუშის მომზადება, რეაქციის ნარევის განაწილება, გაძლიერების პროცესი და სამიზნე რაოდენობრივი განსაზღვრა (ადაპტირებულია [164]-დან).b სქემატური გვიჩვენებს SlipChip წვეთების ანალიზს მაღალი სიმკვრივის დროს წვეთების წარმოქმნისთვის (ადაპტირებულია [71]-დან).c CARMEN-Cas სამუშაო ნაკადის დიაგრამა13 (ადაპტირებულია [158]-დან).d გაფართოებული ციფრული ვირუსის გამოვლენის მიმოხილვა CRISPR/Cas-ით ერთ ქვაბში (ადაპტირებულია [169]-დან).W/O წყალი ზეთში, პოლიდიმეთილსილოქსანი PDMS, PCR პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია, DAQ მონაცემთა შეგროვება, PID პროპორციული ინტეგრალური წარმოებული, CARMEN-ის კომბინატორული მატრიქსის რეაქცია მულტიპლექსური ნუკლეინის მჟავის შეფასებისთვის, SARS-CoV-2, მწვავე მწვავე რესპირატორული სინდრომი, კორონავირუსი 2, RT საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას რეკომბინაზას პოლიმერაზა-RPA გაძლიერება, S/B სიგნალი ფონზე